基于网络药理学和分子对接技术探讨木香治疗胃癌的作用机制*

黄 茜,陈颖志,甘梵飞,陶爱恩

(丽江文化旅游学院医学院,云南 丽江 674100)

木香收载于《中国药典》,为菊科草本植物木香Aucklandia lappa Decne.的干燥根。大量研究表明,木香中含有270余种成分,其中包括具有调节胃肠功能、抗肿瘤、抗菌和抗炎作用的挥发油、萜类、糖苷、氨基酸及胆胺类等物质[1-4]。近年来,随着对木香化学成分、药理活性及临床应用等方面的深入研究,学者们发现木香在抗炎、抗癌、抗溃疡、抗病原微生物及其他多个领域表现出显著的药理活性[5]。药理学研究发现,木香中的活性成分对多种癌细胞具有毁灭作用,但是关于木香在胃癌中的作用研究较少见。本研究借助网络药理学和分子对接技术,通过药物-疾病-作用靶点等多途径调节的理念阐述药物治疗疾病的作用机制,进一步为阐述木香治疗胃癌提供理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 利用中药系统药理学数据库分析平台(TCMSP),对木香的活性成分进行查询,并查阅相关文献。在此基础上,筛选并预测木香关键活性成分和核心靶点。

1.2方法

1.2.1筛选木香成分靶点 使用TCMSP(https://tcmsp-e.com/)检索木香活性成分,筛选活性成分的选择条件为口服生物利用度(OB)大于或等于30%,类药性(DL)大于或等于0.18。通过对整理得到的靶点进行Uniprot(https://www.uniprot.org/)数据校准,以获得标准化的基因名。同时,为了确保所有蛋白名称都符合规范,限定输入蛋白名称所属物种为“Homo sapiens”。

1.2.2胃癌疾病靶点筛选 在GeneCards和DisGeNET数据库中分别使用关键词“gastric cancer”进行搜索,获取相关疾病的靶点。将这些靶点整合并去除重复值,得到最终的疾病靶点集合。将获得的药物靶点与疾病靶点进行相互映射,并利用Venn图确定靶点之间的共同基因。最后,借助Cytoscape3.8.2软件构建一个包含“药物-疾病-作用靶点”网络。

1.2.3木香与胃癌靶点蛋白质相互作用(PPI)网络构建 为了进一步研究木香在治疗胃癌时蛋白质之间的相互作用,将药物-交集基因上传至相互作用数据库String(https://string-db.org/),进行PPI网络构建。选择“Homo sapiens”物种,默认参数,将最终结果保存为TSV格式,导入Cytoscape3.8.2软件中进行网络分析(Cytoscape→Tools→Network analyzer→Network analysis→Analyze network),并保存网络分析结果。用节点大小和颜色反映Degree的大小,节点越大,Degree值越大;边的粗细用于反映Combine score的大小,边越粗,Combine score越大。挑选核心靶点构建PPI网络。

1.2.4基因本体论(GO)富集分析和京东基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析 对于目标基因运用clusterProfiler软件包进行GO富集分析和KEGG通路分析。选择人类物种作为研究对象,以P<0.05作为富集筛选的显著性标准,并提取排名前10位结果。利用Rstudio中的ggplot2软件包进行数据可视化绘图。从生物过程、细胞成分、分子功能3方面注释木香治疗胃癌的作用靶蛋白在基因功能中的作用。为阐明木香治疗胃癌的靶点,在信号通路中进行KEGG通路富集分析。

1.2.5活性成分与靶点的分子对接 使用AutoDock Vina(1.1.2)软件对木香的活性成分和关键靶点进行分子对接,以验证二者的相互作用活性,具体步骤如下:(1)从TCMSP官网下载mol2格式的化合物,在Chembio3D软件中进行能量最小化处理;在AutodockTools-1.5.6软件中导入化合物,并进行加氢、计算电荷、分配电荷等操作,最终保存为“pdbqt”格式。(2)从PDB数据库(http://www.rcsb.org/)中下载与目标蛋白相关的关键靶点蛋白,优先选择人源蛋白,并考虑其与待对接活性成分结构的相似度及高分辨率情况。(3)利用PyMoL(2.3.0)软件去除目标蛋白中原始配体和水分子,并将其导入AutoDocktools(v1.5.6)软件,再进行加氢、计算电荷、分配电荷和指定原子类型等处理,最终保存为“pdbqt”格式。(4)根据目标蛋白原始配体或在报道的关键氨基酸残基附近确定对接盒子中心位置,若无原始配体则选取附近区域作为对接区域。格点盒子大小设置为60×60×60(每个格点间距0.375 Å),其他参数保持默认设置。(5)利用PyMOL和Ligplot软件进行相互作用模式分析。在半柔性对接中,应选择与度值较高的化合物相结合的前5个重要靶点。为了评估小分子与靶蛋白之间的结合情况,可以使用结合能来进行衡量。当结合能小于0时,表示小分子可以自由地与靶蛋白发生结合。数值越小,则代表着更高的结合可能性。

2 结 果

2.1木香活性成分筛选与靶点预测 经过筛选,获得5个木香活性成分,其满足OB≥30%和DL≥0.18,并且这些成分共作用于29个靶点。见表1。

表1 筛选后木香中活性成分

2.2胃癌疾病靶点筛选 通过GeneCards和DisGeNET数据库分别获得15 197、312个胃癌相关基因,将2个数据库的靶点合并去重后得到15 221个共同基因。通过Venny 2.1软件将木箱成分候选靶点与胃癌疾病靶点做交集,获得共同靶点25个。见图1。药物-成分-靶点复合网络如图2所示,该网络共有35个节点,44条边。

图1 木香成分靶点与胃癌疾病靶点的共同靶点

图2 药物-成分-靶点复合网络

2.3核心靶点及网络相互作用 将韦恩图所得的药物靶点与疾病共有的25个靶点导入String数据库,该数据库用于预测蛋白-蛋白相互作用。构建的PPI网络如图3所示,该网络共有23个结点和65条边,其中前列腺素内过氧化物合成酶(PTGS)2、PTGS1、单胺氧化酶(MAO)A、MAOB、SLC6A3为核心靶点。

图3 PPI网络图

2.4生物功能富集分析

2.4.1GO富集分析 共筛选出624个GO条目,其中与生物过程相关的有487个,涉及细胞成分的有49个,包含分子功能的有88项。排名前10位的生物过程、细胞成分和分子功能GO条目见图4。在生物过程方面,主要涉及G蛋白偶联受体(GPCR)信号传递途径、环核苷酸第二信使耦合、平滑肌收缩以及循环系统中的血管调节等。在细胞成分方面,主要包括突触后膜和突触前膜等组成部分。在分子功能方面,主要涉及GPCR的活性、神经递质受体的功能及参与调控突触后膜电位的神经递质受体的作用等。

图4 木香与胃癌交集基因的GO富集分析

2.4.2KEGG通路富集分析 KEGG通路富集结果显示,木香治疗胃癌时可能涉及85条通路,其中排名前10的通路包括神经活性配体与受体的相互作用、钙信号传导途径、血清素的作用、脂肪细胞内脂解调节机制、环磷酸鸟苷-蛋白激酶G信号传递通路、酪氨酸代谢过程、胆碱能突触功能及化学致癌物质对受体的激活效应等。见图5。木香可能通过上述通路调节干预疾病。

图5 木香与胃癌交集基因的KEGG富集分析

2.5分子对接结果 所有小分子均能成功进入靶蛋白的活性中心,为了展示最佳对接效果,选择与每个蛋白质相互作用最好的小分子进行图形化呈现。Benzo(a)carbazole与MAOA的Glu216形成氢键,氢键的长度为3.21 Å;Benzo(a)carbazole与MAOB的Tyr435形成氢键,氢键的长度为3.05 Å;Benzo(a)carbazole与PTGS1的Tyr385形成氢键,氢键的长度为2.81 Å;Benzo(a)carbazole与PTGS2的Tyr385形成氢键,氢键的长度为2.93 Å;Mairin与SLC6A3的HGly386、Asp385形成氢键,氢键的长度分别为3.11、2.83 Å。小分子与周围的氨基酸残基均形成了较强的疏水作用,木香核心成分与核心靶点均对接良好。见表2、图6～10。

图6 Benzo(a)carbazole与MAOA蛋白相互作用模式分析

图7 Benzo(a)carbazole与MAOB蛋白相互作用模式分析

图8 Benzo(a)carbazole与PTGS1蛋白相互作用模式分析

图9 Benzo(a)carbazole与PTGS2蛋白相互作用模式分析

图10 Mairin与SLC6A3蛋白相互作用模式分析

表2 活性成分与核心靶蛋白对接结果

3 讨 论

木香被广泛应用在肿瘤治疗中[6-13]。王绪颖等[14]的数据库处理分析结果显示,木香在肿瘤药物搜索过程中的使用频率排名第2。胃癌在我国的发病率居于世界首位[15]。目前,关于木香治疗胃癌的研究较少见。本文为系统了解木香抗胃癌作用机制,通过网络药理学和分子对接技术对其进行了分析。

本研究通过数据库检索及筛选后获得5个活性成分,分别为Mairin、Sitosterol、Stigmasterol、Benzo(a)carbazole、cynaropicrin,其中Mairin、cynaropicrin为萜类有效成分,主要具有抗炎、抗肿瘤和抗溃疡的作用[16]。郭旭等[17]研究表明,不同水平桦木酸对胃癌细胞的增殖具有抑制性,且呈现浓度和时间依赖性。抗癌机制主要通过改变肿瘤细胞的毒性作用,干扰其细胞周期,有针对性地促使肿瘤细胞发生凋亡、自噬和分化,并阻碍其迁移、侵袭等过程,从而增强机体免疫功能。CHO等[18]成功分离出具有活性的倍半萜内酯(cynaropicrin、reynosin和珊塔玛内酯)。适量使用cynaropicrin时,可以有效地抑制肿瘤坏死因子-α的活性,并且其主要作用是通过抑制炎症介质的生成及限制淋巴细胞的增殖,参与调节炎症反应。大部分植物都含有Sitosterol、Stigmasterol。KUMAR等[19]通过全面的植物化学和细胞毒性研究发现,植物提取物Stigmasterol普遍具有抗癌、抗氧化、抗菌功效。Sitosterol能够提高共刺激细胞的表达水平,进而激活细胞外信号调节激酶信号通路,并增强对SGC7901胃癌细胞的杀伤效果;同时,Stigmasterol能有效抑制胃癌细胞迁移能力,并以剂量依赖性的方式诱导G2/M细胞周期阻滞[20-21]。关于Benzo(a)carbazole的报道较少见,但是从研究中可以看出,其与核心靶点MAOA、MAOB、PTGS1、PTGS2结合能最强。由此可以初步推断,木香主要通过多成分共同对胃癌进行干预。

本研究通过PPI网络分析发现,PTGS2、MAOA、MAOB、SLC6A3、PTGS1为核心靶点,提示木香抗胃癌可能是通过干预核心靶蛋白发挥关键作用。MAO是机体内比较重要的酶,其可以催化生物体在大脑和周围神经组织中产生胺类物质,并促使其发生氧化脱氨反应。根据底物选择性和对抑制剂的敏感度,MAO可分为MAOA和MAOB。作为一种儿茶酚胺类神经递质降解酶,研究者一直将其与精神疾病联系在一起,关于抗肿瘤方面涉及的研究比较少,本研究通过网络分析得到其与胃癌的治疗密切相关。罗家梓[22]研究结果显示,MAOA在胃癌组织中呈现高表达,与胃癌预后呈相关性。PTGS2是一种诱导型酶,在胃肠道肿瘤炎症性微环境中起着关键作用,其功能与炎症和致癌相关[23]。有研究表明,PTGS2高表达会导致癌变的发生,其主要机制是通过调节血管生成、细胞凋亡和细胞因子表达而产生作用,且PTGS2上调与胃肠道癌变有密切关系[24-26]。有研究表明,选择性PTGS2抑制剂塞来昔布对胃癌小鼠胃肿瘤的形成具有抑制作用[27-28]。SLC6A3作为一种转运蛋白,在大脑中主要负责调节多巴胺水平,其表达异常与精神类等疾病相关[29]。肿瘤细胞常利用转运蛋白来维持自身生长,并在多种肿瘤细胞中上调表达,以满足癌细胞快速增殖所需要的能量[30-31]。胃癌组织学类型中提到了神经内分泌肿瘤、神经内分泌瘤,这些类型肿瘤的产生是否与SLC6A3的表达有关,目前尚不明确。

本研究通过GO分析和KEGG分析发现,相关通路涵盖了癌症、炎症等多个方面。GPCR在信号传递过程中扮演着核心角色,影响多种细胞功能。越来越多的研究表明,在肿瘤生物学领域,GPCR及其配体具有重要作用。G蛋白偶联受体激酶(GRKs)是一类包含7种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,能够特异性地激活GPCR。哺乳动物的GRKs可分为3个亚组:视紫红质激酶(GRK1、GRK7),β-ARK亚组(GRK2、GRK3)及GRK4亚组(GRK4、GRK5、GRK6)。通过磷酸化反应,GRK3可以调节广泛的受体功能,并使β-肾上腺素及相关GPCR的激动剂发挥作用。李源等[32]研究结果显示,与非癌组织相比,胃癌及其配对癌旁组织GRK3表达水平在癌组织中呈上升趋势。此外,胃癌患者G蛋白偶联受体35(GPR35) mRNA表达水平上调,且其与患者存活期显著相关,提示GPR35可能成为评估胃癌预后及开展靶向治疗时有价值的生物学指标[33]。

综上所述,木香主要通过多成分共同对胃癌进行干预,其可能是通过干预核心靶蛋白发挥关键作用。但是,在研究过程中对于成分采用的数据库不全面,并未做进一步的实验进行验证,因而只能为抗胃癌新药的研究与开发提供理论参考和思路。