三种中草药及配伍药提取物体外抗氧化部位筛选

胡新梦,吴建丽,周芳,张强,何江龙

(黄河科技学院 医学院,河南 郑州 450000)

山慈姑中药材是干燥的兰科植物独蒜兰Pleionebtdbocodioides(Franch)Rolef、杜鹃兰Cremastraappendicutata(D.Don)Makino或云南独蒜兰PleioneyunnanensisRolfe的假鳞茎[1-2]。味甘微辛,归肝经脾[3]。现代医学经过证实,山慈菇能治疗多种癌症,常被用作基础性的治疗癌症药物,是一个治疗癌症的常用的药物[4-5]。两头尖是干燥的毛茛科Ranunculaceae植物多被银莲花AnemoneraddeanaRegel的根茎,又名草乌喙[6]。两头尖中以三萜皂苷抗肿瘤、抗风湿作用明显,有很好的开发前景[7]。现代药理研究发现还具有抗癌的作用功效,广泛用于对恶性肿瘤的临床治疗[8]。藤梨根Actinidiaarguta(Sieb.&Zucc)Planch.exMiq.,是侧膜胎座目,猕猴桃科猕猴桃的根[9]。《草药土方》中记载有清热散疖、祛风健脾、利湿消肿、除痹化痰等功效;对风湿痹痛消化道癌肿,痈疡疮疖等有良好效果,是我国特有的品种[10]。现代研究表明藤梨根对多种癌症有明显抗癌作用,抑制细胞增殖,激发细胞凋亡[11]。目前藤梨根在治疗肿瘤方面的作用被医学界重视关注,深入研究藤梨根有利于利用天然药物资源开发新的药物[12]。

中医治疗癌症常将多种中药材配伍熬制成汤药给病人口服,为进一步的抗肿瘤活性检测提供理论依据和研究参考,现将三种药材配伍后熬制进行提取和简单初步分离后用DPPH法对分离物质进行抗氧化活性检测后对比[13-14],找出其抗氧化活性部位并进行分析,并与单体抗氧化活性部位比较,为后续具体抗氧化活性物质检测和抗肿瘤活性研究做初步筛选并提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山慈菇、两头尖、藤梨根:均采自张仲景大药房,洗净,晒干,粉碎,过80目筛(筛孔孔径0.178 mm),备用;DPPH、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、无水乙醇、抗坏血酸:分析纯;石油醚(沸点:60～90 ℃);纯化水。

1.2 仪器与设备

FA1004型电子天平:上海良平仪表有限公司;XFB-200型摇摆式粉碎机:吉首市中城制药机械厂;2XZ-2真空干燥箱:北京中兴伟业仪器有限公司;DF-101S旋转蒸发仪:北京凯亚仪器有限公司;SB-1100恒温水浴锅;KQ-300V超声波清洗仪;JH7230G型可见分光光度计:上海菁华科技仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 配伍中药材及单一中药材各成分的提取分离流程

称取混合配伍药材粉末47 g(含山慈菇药材粉末12 g,藤梨根药材粉末20 g,两头尖药材粉末15 g),将称量好的原料药材粉末混合均匀后倒入250 mL圆底烧瓶,用150 mL的体积分数95%EtOH进行加热回流,6 h后进行过滤,提取两次,合并滤液后将其置入旋转式蒸发器进行加热旋转,浓缩至浸膏状[15]。之后将三种药材混合提取液浸膏,溶于水中后,按由小至大的极性顺序,依次用石油醚→氯仿→ACOEt→n-BuOH萃取3次后,得到五种层分(石油醚层、氯仿层、ACOEt层、n-BuOH层、水层)[16]。之后用旋转式蒸发仪浓缩,用真空干燥机制得干粉备用[17]。单一药材藤梨根粉末47 g、两头尖粉末47 g以上述同一方法制成干粉备用。

1.3.2 试剂配制

取0.039 4 g DPPH,用EtOH溶液进行快速溶解,定容于100 mL大的干燥棕色玻璃容量瓶中,制成1 mmol/L的无水DPPH乙醇溶液,避光冷藏保存,一周以内使用完全,使用时用EtOH稀释10倍使用,现用现配[18]。

1.3.3 阳性对照

取维生素C 的标准品0.020 2 g加水快速溶解定容,制成0.2 mg/mL的维生素C标准品溶液,过后分别稀释成0.000,0.002,0.004,0.006,0.008,0.010 mg/mL的维生素C标准品稀释溶液,分别选择10 mL和相同体积0.1 mmol/L无水 DPPH乙醇溶液振荡混合摇匀后,于水浴30 ℃下等候30 min后,并在517 nm用无水乙醇为空白,测定吸光度值三次,求得吸光度平均值,计算维生素C标准品溶液各浓度DPPH+清除率,以作为阳性对照[19-20]。

CLDPPH+=(Ab-As)/Ab×100%

第五，巩固党的群众路线教育实践活动的成效，广泛开展精神文明创建和文化建设，落实中央八项规定，改进作风，力戒心浮气躁，倡导脚踏实地、真抓实干；落实党风廉政建设责任制，严格干部管理；加学习党组织建设，完善民主决策机制，充分发扬党内民主，营造团结干事的浓厚氛围。

式中:CLDPPH+:DPPH+清除率;

Ab:空白样品吸光度值;

As:样品吸光度值。

1.3.4 样品测定

分别称取混合配伍药材石油醚层、CHCl3层、ACOEt层、n-BuOH层、水层提取物各0.020 0 g,分别定容于100 mL容量瓶中,制成0.2 mg/mL的混合配伍药材各层样品溶液为母液,分别稀释成0.000,0.002,0.004,0.006,0.008,0.010 mg/mL的溶液,各取10 mL和等体积0.1 mmol/L DPPH+无水乙醇溶液振荡混合摇匀,于30 ℃水浴条件下反应30 min后,观察色彩和颜色的反应变化,同时以无水乙醇为空白,在517 nm处,测定吸光度值三次,求得吸光度平均值。建立显示DPPH+清除率与混合配伍药材各层溶液浓度之间的柱形图。单一药材提取物以同样的方法进行样品的测定及观察分析对比。

1.3.5 数据汇总分析

将各个相同药材不同提取层分数据汇总在一起进行分析,筛选出单个药材中抗氧化活性较强部位;将不同药材同一层分数据汇总在一起进行分析,筛选出同一部位哪种药材抗氧化活性较强;并将单一药材抗氧化活性同混合配伍药材抗氧化活性数据对比,探究混合配伍是否能提高原药材抗氧化活性。并给出筛选的抗氧化活性较强部位,供抗氧化具体活性成分研究和抗肿瘤活性测定研究。

2 结果与分析

2.1 三种药材各层成分不同浓度DPPH+清除率汇总

表1 三种药材各成分不同质量浓度DPPH+清除率汇总表

2.2 三种药材石油醚层提取物的抗氧化活性对比分析

如图1三种药材石油醚提取物抗氧化活性分析图所示,随着石油醚提取物溶液浓度的不断持续增加,藤梨根的石油醚层的提取物清除DPPH+自由基的能力也持续不断地上升,但效果不明显;两头尖的石油醚层的提取物清除DPPH+自由基的能力则持续不断地呈逐渐下降的趋势;而混合配伍药材的石油醚提取物抗氧化活性逐渐增强且效果明显。因此在三种药材的石油醚提取物中抗氧化能力最强的是混合配伍药材。

图1 三种药材石油醚提取物抗氧化活性分析图

2.3 三种药材氯仿层提取物抗氧化活性对比分析

如图2所示,DPPH+自由基的消除能力随着藤梨根CHCl3层的提取物溶液浓度的增加逐渐增强,但效果不明显;两头尖的氯仿提取物浓度较低时未表现出清除DPPH+自由基的抗氧化能力,当浓度高时抗氧化能力明显增强;而混合的配伍药材的CHCl3层的提取物对DPPH+自由基的消除能力相对于另外两种较稳定,但它的抗氧化能力不强。

图2 三种药材氯仿提取物抗氧化活性分析图

2.4 三种药材乙酸乙酯层的提取物抗氧化活性对比分析

如图3所示,DPPH+自由基的去除能力伴随着藤梨根的ACOEt层提取物溶液浓度的增加不断地逐渐增强,且增强的效果很明显;DPPH+自由基的消除能力随着两头尖的ACOEt层提取物浓度的增加也在逐渐持续不断地增强,呈快速上升趋势,但同藤梨根和混合配伍药材相比抗氧化能力较弱;混合配伍药材的乙酸乙酯层提取物对DPPH+自由基的清除能力同样呈上升趋势,增强效果明显高于单一药材的乙酸乙酯提取物,其抗氧化能力高于藤梨根和两头尖。因此在三种药材的乙酸乙酯提取物中抗氧化能力最强的是混合配伍药材。

图3 三种药材乙酸乙酯提取物抗氧化活性分析图

2.5 三种药材n-BuOH层提取物抗氧化活性对比分析

如图4所示,随着正丁醇提取物浓度的进一步不断增加,藤梨根的n-BuOH提取物对DPPH+自由基的分解和去除能力逐渐提高,且其效果明显;两头尖的n-BuOH提取物对DPPH+自由基的分解和清除能力也逐渐增强,但与藤梨根和混合配伍的药材相比,它的抗氧化能力较弱;混合的配伍中药材的n-BuOH层的提取物质对DPPH+自由基的去除能力呈现出明显的持续上升趋势,它的抗氧化能力高于藤梨根和两头尖。所以在三种药材的n-BuOH提取物中抗氧化性能最好的是混合配伍药材。

图4 三种药材正丁醇提取物抗氧化活性分析图

2.6 三种药材水层提取物抗氧化活性分析

如图5所示,随着三种药材中水提取物浓度的进一步增加,藤梨根的水提取物对DPPH+自由基的去除能力逐步增强,但是效果不明显;两头尖的水提取物对DPPH+自由基的清除能力一直为0,可以确定两头尖的水提取物不具有抗氧化的能力;混合的配伍药材的水提物质对DPPH+自由基的消除能力呈现出持续不断上升趋势但是效果不明显,其抗氧化能力低于藤梨根。因此在三种药材的水提取物中抗氧化能力最强的是藤梨根药材。

图5 三种药材水提取物抗氧化活性分析图

2.7 藤梨根药材各部位提取物抗氧化活性分析

如图6所示,随着藤梨根各部位提取物浓度的提高,石油醚、CHCl3、ACOEt、n-BuOH、水五种层分的提取物均对DPPH+自由基的去除能力有所增强,说明五种层分中均含有可以对抗氧化的物质,均具有提高抗氧化作用,通过图6抗氧化作用浓度增长趋势可以明显地看出藤梨根的ACOEt提取物和n-BuOH提取物的抗氧化活性能力远远超出了其他层分的提取物,由此进行分析,可以得出结论:藤梨根药材的抗氧化活性部位为ACOEt部位和正丁醇部位。

图6 藤梨根各部位提取物抗氧化活性分析图

2.8 两头尖药材各部位提取物抗氧化活性对比分析

如图7所示,随着两头尖各层次提取物浓度的持续不断增加,石油醚、CHCl3、ACOEt、正丁醇、水五种不同层次成分的提取物对DPPH+自由基的去除分解能力均有所增强提高,说明四种层分中均含有抗氧化的物质,均具有抗氧化能力;但是两头尖的水层提取物随着浓度的提高没有表现出抗氧化的能力,其对DPPH+自由基的清除率一直为0%,因此可以确定两头尖药材的水提取物不具有抗氧化的能力。通过图7抗氧化增长趋势可以明显看出两头尖的ACOEt提取物和氯仿提取物对DPPH+自由基的抗氧化能力远高于其他层分的提取物,由此分析,可以得出结论:两头尖药材的抗氧化活性部位为ACOEt部位和氯仿部位。

图7 两头尖各部位提取物抗氧化活性分析图

2.9 混合配伍药材各部位提取物抗氧化活性分析

如图8所示,随着混合配伍药材各部位提取物浓度的提高,石油醚、CHCl3、ACOEt、正丁醇、水五种不同层次成分的提取物对DPPH+自由基的消除能力均有所增强,说明五种层分中均含有抗氧化的物质,均具有抗氧化能力,通过图8抗氧化增长趋势可以明显看出混合配伍药材的乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物的抗氧化能力远高于其他层分的提取物,由此分析,可以得出结论:混合配伍药材的抗氧化活性部位为乙酸乙酯部位和正丁醇部位。

图8 混合配伍药材各部位提取物抗氧化活性分析图

3 结论

山慈菇、两头尖、藤梨根三种中药材古籍记载均具有消痈散结、清热解毒等功效,近年临床研究发现有抗癌的功效,但对这三种药材研究相对较少,相关记载较为久远,通过对藤梨根、两头尖活性部位的筛选鉴定,为以后充分开发该药用植物提供理论基础。

本试验通过萃取和分离提取得藤梨根、两头尖及配伍混合药材各个部位,对提取物用DPPH法进行了抗氧化活性的初步筛选,筛选甄别结果表明:中药材藤梨根的抗氧化活性部位主要分布在n-BuOH部位和ACOEt部位;中药材两头尖的活性成分部位主要为ACOEt部位和氯仿部位;混合配伍药材中的活性成分部位主要为ACOEt部位和n-BuOH部位,同阳性对照维生素C标准品对比,混合药材的乙酸乙酯层和正丁醇层分别在0.008 mg/mL和0.006 mg/mL质量浓度下的抗氧化活性超过了阳性对照品。其中混合配伍药材的乙酸乙酯层提取物、正丁醇层提取物;藤梨根药材的乙酸乙酯层提取物、正丁醇层提取物这四部分提取物都出现了由紫色变为黄色的过程,这说明这四种层分具有较强的抗氧化能力,这些部位中具体是何种活性物质还有待进一步研究。同时也有力地证明了中药配伍可以提高药物的活性。

本试验为后续研究这三种中草药提取物及配伍提取物抗肿瘤活性与检测缩小了筛选范围同时也提供了前期必要的准备和科学的参考依据。为发现、开发具有自主知识产权的抗癌新药打下良好基础。