转基因检测标准的方法验证工作研究

章寅，贾军伟，白蓝，陈一帆，阮功成，吕贝贝*，潘爱虎*

1.上海市农业科学院生物技术研究所，上海市农业遗传育种重点实验室；农业农村部农业转基因生物安全评价（环境）重点实验室；农业农村部农作物生态环境安全监督检验测试中心（上海），上海 201106；2.越南北江农林大学，越南 北江 21000

转基因技术属于基因工程领域的遗传转化技术，是现代农业育种技术的核心技术［1］，它通过打破物种间的界限，从而实现作物目标性状的定向改变，在缓解资源约束、减少生态环境污染、改进农产品质量、节水增效、拓展农业功能等方面显示出重要作用和巨大潜力［2］，农业转基因技术已成为世界各国增强农业核心竞争力的战略选择［3］。

发展转基因是我国农业的重大战略决策。2020 年2 月26 日，农业农村部办公厅印发关于《2020 年农业农村科教环能工作要点》的通知中提到，组织实施转基因生物新品种培育重大专项，进一步强化生物育种技术研究和产品熟化。转基因将成为保障我国粮食安全、实现种业振兴的重要手段之一。转基因检测标准能为转基因食品的有效标识、科学监管、推广应用提供重要的技术支撑。详细有效的转基因标准方法验证指南将为我国转基因标准体系的应用推广提供参考和技术指导。

1 转基因检测标准体系

转基因检测标准是农业转基因生物安全管理必不可少的技术保障［4-7］。在《农业转基因生物安全管理条例》《农业转基因生物安全评价管理办法》等配套管理办法的指导下，农业农村部和国家质量监督检验检疫总局等相关部门组织制定了转基因生物安全检测标准体系框架和标准修制订规划［4，8-9］。

现有标准中覆盖了大豆、水稻、玉米、油菜、棉花、小麦、苜蓿、甜菜、番茄等转基因作物，以及常用的抗病毒、抗虫及耐除草剂基因、报告基因、内标准基因等检测项目［10］。检测标准在被相应的实验室使用之前，需要实验室按照《ISO/IEC17025：2017 检测和校准实验室能力的通用要求》或《CNAS-CL01：2018 检测和校准实验室能力认可准则》的要求开展方法验证工作，证实实验室具备进行转基因准确检测的能力。但是上述两项标准只给出了方法验证的定义，并没有具体开展的操作指南，同时现有的文献中关于转基因检测方法的验证缺少科学性、有效性的参考依据，故对于开展转基因检测标准的方法验证分析研究有迫切的需求。

2 转基因检测标准方法验证的关键点

2.1 仪器设备检定校准

转基因检测数据一部分主要依靠仪器设备直接获得，因此仪器设备的状态对检测结果有着直接的影响。开展标准方法验证之前需要确认仪器设备的灵敏度、准确度、稳定性是否满足要求。

转基因检测实验室主要以出具定性结果为主，对仪器设备的性能指标更加重视。关键设备如定性PCR 仪、实时荧光PCR 仪、凝胶成像系统等目前缺乏检定或校准规程，故无法送至计量检定部门进行检定或校准，实验室可以参加农业农村部组织的仪器比对或周期性地开展内部校准和功能性检查。其他关键设备如电子天平、移液器等则需送至计量检定部门检定或校准。

2.2 关键试剂及标准物质验收

针对转基因定量检测标准［11］，标准物质样品是检测结果可比、有效和可溯源的重要保障。检测标准要求在验证工作开始前，需准备相对应的标准物质样品［12］。目前，有资质研制转基因标准物质的单位/机构包括美国油脂化学家学会、欧盟联合研究中心、中国农业农村部科技发展中心等［13］。标准物质也分为基体标准物质、基因组DNA 和质粒DNA 标准物质［14-16］。方法验证时需要根据实际的样品种类、含量以及形态特征选择合适的标准物质。通过标准物质的测定值来核实标准验证的有效性和准确性［17］。

除了标准物质，DNA 提取试剂盒、DNA 聚合酶、引物、探针、PCR 反应缓冲液等也是转基因检测中的关键试剂耗材，标准验证过程中需要对其进行严格的验收，并做好验收记录。

2.3 技术参数验证

精密度、线性范围、检出限和定量限是标准验证中需要进行有效验证的特性参数，上述指标在食品理化检测标准中有详细的操作步骤和技术要求，转基因检测属于分子生物学检测范畴，缺少此类的验证技术指导。国际上进行转基因检测方法验证的研究可参考欧盟联合研究中心的权威指南文件《Verification of analytical methods for GMO testing when implementing interlaboratory validated methods》（EUR 24790 EN，JRC）。上述指南中规定，准确度验证至少选择包括接近定量限在内的3 个不同浓度水平进行验证，每个浓度水平要得到16 个PCR平行结果，平均值通过一定的计算公式计算，结果应在可接受参考值的±25%内。重复性验证主要通过PCR 平行试验进行评估，选取5%、1%、0.5%、0.1%这4 个不同转基因含量的样品进行检测，每个水平至少要得到16个独立测量结果，计算得到相对可重复性标准差，要求结果应在可接受参考值的±25%内。定量限的验证用一个低转基因浓度的阳性对照样品的至少10次PCR平行重复来测量，如果所有的平行重复结果都是阳性，这表示实验室的定量限低于或等于该标准中设定的阳性对照水平［18-19］。

2.4 环境区域隔离

在开展验证之前，需要保证实验环境未被污染。转基因检测主要针对DNA、蛋白质等生物大分子，检测方法又具有高灵敏性，实验室需要重点考虑气溶胶污染和交叉污染。因此日常实验室需要有效分区，检测区和实验室要隔离，可设置为试剂准备区、样本准备区、扩增区、产物检测区等。对空调、生物安全柜等设施定期保养维护。有条件的实验室安装空气过滤系统，并时常进行房间通风，定期进行紫外线照射，有效控制气溶胶对标准方法验证的影响［20-21］。

3 转基因检测标准方法验证工作建议

3.1 积极参加能力验证工作

实验室内自身开展的转基因方法验证工作属于内部质量控制方法的一种，能有效监控实验室在技术能力、资源配置、体系保证等方面的符合程度，但该方法无法有效消除实验室内误差，而参加能力验证则可以很好地解决这一问题。通过参加权威能力验证单位组织的验证工作，转基因检测实验室可直观判定本实验室检测结果的准确性，及时识别出实验室存在的质量问题，从而更好地评价转基因标准方法验证工作。

3.2 注重积累定量检测方法验证经验

现有的转基因标准以定性检测为主，在方法验证过程中缺乏对数据定量结果的验证工作。随着转基因标识制度在中国及国际上的不断推行，很多国家不仅要求对转基因食品进行定性检测，更加会对定量检测提出需求，故转基因检测实验室需要加强对检测数据真实性、准确性等方面的验证工作，同时要对数字PCR 等一系列定量检测仪器的计量校准工作提前准备。国外转基因含量标识的阈值一般在0.9%～5%之间［22］，标准方法在验证过程中要更加注重这几个点的验证工作，有条件时还需要完成不确定度的评价工作，以便为标准方法的验证工作提供更加全面完善的信息。

3.3 拓展标准物质的日常质量控制

转基因检测过程中，要同时设置阴性对照、空白对照和阳性对照，以此来确保实验过程的可塑性和可比性，故实验室要将标准物质纳入到日常的质量控制中。标准物质可以购买大豆、玉米、油菜等作物特定品系的阳性标准物质，也可以购买目前研究比较热门的阳性标准质粒分子。已有报道将包括CaMV35S 启动子、NOS 终止子在内的8 个调控原件转化到质粒上，形成阳性标准质粒分子，可用于转基因成分的检测与研究。该方法不仅能减少阳性物质的反复提取，降低污染，同时能覆盖大多数转化体，提高检测的覆盖面。

3.4 探索引入国际GLP质量管理准则

良好实验室规范（good laboratory practice，GLP），作为一种国际认可的实验室质量管理体系，常被应用于医药、食品等重要领域的非临床安全性评价试验中。转基因检测数据成为监管部门作出行政审批的技术依据，直接关系着我国转基因技术未来的发展方向，世界上美国、欧盟等发达国家均已将其应用于转基因生物领域。在将来的转基因标准方法验证工作中，可以探索引入GLP 准则中的质量要求，从而更好保障数据的真实性和可追溯性，以期为转基因生物安全管理、研发和产业发展提供借鉴。

4 展望

转基因检测技术标准是保证我国转基因生物安全管理制度顺利实施的重要技术支撑，随着我国生物育种产业化的推进，转基因作物的商业化种植和转基因研发新技术的不断发展，转基因研究试验、生产加工、进出口和标签标识等方面的监管任务剧增，我国必然需要增加转基因检测的技术力量。建立一套详细、严谨的转基因标准方法验证标准规程，保障检测结果的真实性、准确性、可比性和溯源性，有利于各家机构统一化、高标准地开展方法验证工作，同时便于监管机构开展对检测机构的评审考核工作，进一步提高转基因检测体系的能力水平，促进我国转基因检测水平与国际对标，为我国农业生物安全监管工作提供坚强的技术支撑。未来转基因标准方法验证规程需要具备以下几方面的要求。

首先，验证规程需要适用多类型机构。转基因监管的检测机构数量需要进一步增加，除了部级质检机构、出入境检验检疫机构等政府实验室，还应将社会实验室补充进入转基因政府监管工作中。这些机构在建设布局、条件水平、质量体系、运行模式，检测能力等方面存在巨大差异，而转基因检测工作很敏感，公众关注度高，检测数据的真实性要求高。验证规程要适用大部分的转基因检测实验室，以同一尺度开展验证工作，从仪器设备检定校准、关键试剂及标准物质验收、技术参数验证、环境区域隔离等关键参数开展验证工作。

其次，验证规程需适用于新型标准物质。转基因检测标准物质作为实物标准，对支撑转基因检测工作的开展、数据的准确性、有效性和可追溯性具有重要意义。国务院印发的《计量发展规划（2021—2035 年）》要求“建立完善以国家基准物质、国家标准物质和工作标准物质为主要组成部分的标准物质体系”，要求加快重点领域的标准物质研制和应用。随着农业农村部转基因重大专项“基因检测标准物质研制”等项目的实施，我国已经具备研发转基因定量检测标准物质的能力［23］。未来除了现有的基体标准物质、基因组标准物质，新型的质粒标准物质也将成为方法验证中重要的标准物质［24］，其具有制备灵活、不受样品影响、性质简单、可操作性强等优点，将成为转基因检测标准方法验证重要的技术材料。

最后，验证规程需适应新型检测标准。目前，国内转基因标准体系中的主流技术为普通PCR，将来随着转基因作物分子特征分析、精准定量、标准物质定值等工作的开展，精准定量、快速检测技术、高通量检测技术、基因编辑产品检测标准数量将增加［25-26］，实验室需要做好相应的标准技术和标准能力的储备工作。