血清学检测与PCR 技术在生猪常见疾病防控中的应用进展

张婷婷 泉州市泉港区农业农村和水务局 福建泉州 362801

1 检测方法与技术

1.1 血清学检测 血清学检测是一种常用的猪疾病检测方法， 基于体外的抗原-抗体特异性结合反应[1]。 在临床上，可以利用已知的抗原或特异性抗体来鉴定患畜血液中相应的抗体或抗原。 利用血清学检测技术，不仅能够评估猪群的免疫效果、监测疾病的流行情况，而且还可以确定最佳免疫时机，制定更为合理的免疫计划[2]。 常见的血清学反应根据抗原-抗体反应所产生的现象与结果， 可大致分为以下五种类型：凝集反应（直接凝集和间接凝集）；沉淀试验（絮状沉淀试验、琼脂扩散试验和免疫电泳）；补体结合反应；标记抗体反应（荧光抗体、酶标抗体、放射性标志抗体和发光标志抗体等）；中和反应。

1.2 聚合酶链式反应技术 聚合酶链式反应（PCR）是一种新型的实验室技术，在医学领域、生物学、兽医等领域均广泛应用。 PCR 的优势之一就是可以在体外进行DNA 复制， 将少量甚至是微量的DNA 进行大量扩增，有利于对疾病或病原微生物等进行鉴定。

2 猪场常见疾病检测的研究现状与进展

2.1 猪瘟 猪瘟 （CSF） 是由猪瘟病毒 （CSFV）引起的一种高度接触性传染病， 可造成全球性范围的传播感染[3]，被列为我国中长期动物疾病防治规划（2012-2020）中优先防控的十六种动物疾病之一[4]。虽然猪瘟兔化弱毒苗在一定程度上抑制生猪疫情的大面积传播， 但我国许多地方还是有零星暴发或小规模传播，而且伴有非典型猪瘟、温和型或繁殖障碍型猪瘟，为猪瘟的防治增加了新的难度。

Tu 等[5]将分离自中国的130 株猪瘟病毒的E2基因序列进行分析， 发现我国流行的猪瘟优势毒株主要是基因1 型和2 型。 张洪亮等[6]通过对一些已进行猪瘟免疫的规模猪场所出现的疑似猪瘟感染病例进行猪瘟病毒的分离鉴定， 发现所分离到的毒株为2.1d 基因亚型。 魏春华等[7]利用PCR 技术对E2基因进行扩增及序列分析， 发现所分离的毒株属于1.1 亚群和2.1 亚群。焦秋林等[8]建立E2 基因的遗传进化树， 表明分离株与2.1d 亚群毒株亲缘关系最近， 属于变异毒株。 这些研究都指出相应地区的猪瘟病毒流行株正在向远离疫苗株的方向变异。

随着猪瘟病毒流行的不断发展和变化， 临床症状逐渐非典型化，因此，为了更加快速准确地做出判断，往往需要结合实验室诊断结果进行判断。常用的猪瘟病毒实验室诊断方法有正向间接血凝试验（IHA）、间接ELISA、 胶体金免疫层析试纸条（GICA）和琼脂扩散试验（GDP）等。 感染猪瘟病毒后，一般在10～15 d 内即可出现中和抗体，利用ELISA 方法可及时检出。 马超英等[9]应用IHA、ELISA、GICA 和GDP 这四种方法分别对142 份猪瘟阳性血清样品进行检测， 研究结果显示间接ELISA 的灵敏性最高，而胶体金层析试纸条的灵敏性最低。

目前， 仍有不少猪场中出现猪瘟病毒感染和免疫计划失败的现象， 而导致该现象的主要因素除流行的病毒株在变化外， 更主要的因素则是部分猪场的猪瘟疫苗免疫规划不能严格地根据血清学检查结果来制订，从而造成在错误的时机免疫，引起母源抗体干扰从而导致免疫计划失败[10-11]。 通过血清学方法检测猪瘟的抗体水平， 一方面可以直接反映猪群的健康状况， 另一方面养猪场可以直观了解到现行的免疫程序是否合适，而且通过猪瘟抗体的检测，还可以及时淘汰不能留作种用的后备种猪。

2.2 猪繁殖与呼吸障碍综合征 猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是一种“灾难性”疾病，传播迅速。 该病的病原是猪繁殖与呼吸综合征病毒 （PRRSV），可以感染任何日龄的猪， 以妊娠母猪和哺乳仔猪最易感[12-13]。

PRRS 抗体的检测方法有ELISA、胶体金免疫层析试纸条（GICA）和免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）。 IPMA 检测方法由Wensvoort G 等建立，不但能够用于检测抗原，而且可用于检测抗体，是欧洲很多发达国家使用的血清学检测方法。 ELISA 检测方法是我国检测PRRS 抗体最常用的方法， 适合用于大规模样品的检测。在抗体阳性的基础上，再利用RT-PCR 技术对PRRSV 进行检测，可以提高检测的准确性。使用血清学检测方法，可以协助猪场筛查后备种猪、淘汰阳性表达的感染型种猪，并有效检测是否出现了持续性感染猪只， 是猪场及早进行制订免疫规划及净化计划的工具基础[14-15]。

2.3 口蹄疫 口蹄疫（FMD）是一种由口蹄疫病毒（FMDV）引起的可感染偶蹄类动物（如猪、牛、羊）的高度传染水泡性疾病[16]。 幼龄动物感染后的病死率接近100%[17]； 成年动物感染口蹄疫后虽然病死率低，但是发病率极高，严重影响感染动物的正常生长发育， 导致生产能力大幅减少， 被定为一类动物疫病[18]。

口蹄疫从发现到现在已有500 多年的历史，其中流行范围最广的是O 型[19]，几乎所有的国家都暴发过口蹄疫，引起了各个国家的高度重视[20]。虽然我国对口蹄疫的防控措施到位， 但是目前仍有部分地区散发性出现，主要原因是从国外引种，导致国外毒株不断传入，因此，针对口蹄疫进行快速诊断必不可少[21-22]。

口蹄疫的血清学检测方法，一般分为ELISA、病毒中和试验（VNT）、琼脂扩散试验（AGID）、补体结合试验（CFT）、免疫荧光试验（IFA）、凝集试验（AT）和正向间接血凝试验（IHA）。 其中，ELISA 方法应用最为广泛，研究也最多。目前在我国相对成熟的有亚洲I 型、O 型和A 型固相含量竞争ELISA 抗体筛查方法和非结构蛋白抗体的特异性单抗阻断ELISA。高得吼等[23]为了节省IHA 的血凝抗原，在不影响检测结果的情况下，探索和改进了原来的IHA 检测方法，对IHA 标准进行了简化，并分别进行了乳牛和仔猪口蹄疫O 型血清抗体的测定，数据统计分析发现，免疫合格率也分别超过了97.5%和92.5%，在此基础上，不仅减少了检测成本，同时还节约了检测时间，提高了检测效率。卢顺等[24]使用人工合成的包括有O 型口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC 上主要抗原表位中原核表达的蛋白质为包被体抗原， 并使用间接ELISA， 确定了抗原的最大包被物含量和对新鲜血清样本的最佳溶液稀释率， 对原来的间接ELISA方案加以优化， 首先对临床上220 份猪血清进行测定，同时用上海优耐特VP1 结构蛋白ELISA 试剂盒进行重复测定， 结果表明2 种试剂盒检测结果的总符合率为87.27%。

2.4 猪圆环病毒病 猪圆环病毒病（PCVD）是由猪圆环病毒（PCV） 引起的一种多系统功能障碍性疾病，导致机体免疫抑制，临床上以新生仔猪先天性脑震颤和断乳仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）最为常见[25-26]。 由于PCV-2 能够对感染动物的免疫产生破坏，引起免疫抑制，所以，养殖户必须做好定期的血清学检查来确定猪群的抗体水平， 判断疫苗免疫是否成功[27-28]。

常见的PCV-2 抗体筛查手段有间接ELISA、竞争ELISA、胶体金免疫层析试纸条（GICA）和间接免疫荧光试验（IFA）。 李春燕等[29]将非结构蛋白ORF3用作包被性抗原， 建立PCV-2 的间接ELISA 检测法，检测结果与PCR 检测结果高度一致，有利于在临床上对rCap 蛋白基因工程苗免疫的猪场进行鉴别诊断。 欧阳素贞等[30]用间接ELISA 方法检测338份血清中PCV-2 抗体阳性率为40.6%，引起养殖户和相关部门的重视，及时干预，避免造成不必要的损失。 王慧杰等[31]将PCV-2 的衣壳蛋白与胶体金免疫技术融合，形成了一个全新的抗体胶体金检测方式，可以高效分辨PCV-2 的标准阳性血清与阴性血清，同时具有较大的生物特异性。 芦银华等[32]使用猪肾传代细胞系PK-15 来扩增PCV-2 制备抗体， 并建立对PCV 的抗体间接免疫荧光试验， 为PCV 的流行病学调查提供了一种新的手段。

2.5 伪狂犬病 伪狂犬病（PR）是由疱疹病毒科的伪狂犬病毒（PRV）感染引起的一种急性传染病，而且感染了PRV 的猪会终生带毒并向体外持续排毒，感染其他动物[33]，被纳入“中国中长期动物疫病防治规划（2012-2020）”，但目前尚未实施强制免疫接种政策。 因为PRV 容易通过空气传染，同时也会引起潜伏传染，对伪狂犬病的预防造成很大的麻烦[34-35]。目前，国际上针对伪狂犬病的防治主要采取隔离、检疫、淘汰阳性感染和免疫接种[36]。

常见的PR 抗体测定方式有ELISA、 乳胶凝集试验（LAT）、GICA、SNT 和IFA 法等。 国内外实验室广泛使用的是gB/gE-ELISA 方法，对待检样品中的抗体具有高度的特异性[37]。 其中gB-ELISA 一般用于评估疫苗的免疫水平，gE-ELISA 一般用于检测是否发生PRV 野毒株感染。 gE-ELISA 是针对疫苗株中存在缺失的gE 糖蛋白质而形成的一个鉴别ELISA，具有高度灵敏性和特异性。Kimman 等[38]以杆状病毒表达的gE 重组蛋白作为抗原， 形成了一个全新的间接型双抗夹心gE-ELISA。黄骏明等[39]用混合纤维素酯的微孔过滤器用作固相支撑物进行斑点-ELISA (Dot-ELISA)， 与常规试剂盒相比，Dot-ELISA 法的阳性检出率明显高于常规试剂盒，且已投放市场使用。 王生育等[40]采用ELISA 试剂盒和GICA 方法对64 份猪血清进行测定，2 种方法的测定准确率高度统一， 说明2 种方法都可进行实验室检查，具有微量、特异、准确的优点。

4 总结与展望

血清学检测作为一种常规的疫病监测手段，在生猪养殖业中得到广泛应用， 通过检测动物体内的抗体水平，可以迅速诊断某些病原的感染情况。PCR技术作为一种分子生物学技术， 也广泛应用于生猪常见疾病病原检测和监测。 PCR 技术可以通过检测病原的核酸序列，实现对病原的高灵敏度、高特异性检测。 总的来说，血清学检测和PCR 技术在生猪常见疾病防控中的应用前景十分光明。 随着技术的不断突破和创新，两种技术将发挥更大的作用，为生猪行业提供更准确、 快速和精细化的疫病诊断和防控措施，保障生猪生产的健康和可持续发展。 未来，期待可以借助更先进的技术平台和更全面的抗原检测，实现对更多病原的敏感、准确和高通量检测，以加强疫病监测和防控工作。