分子动力学模拟结合相溶解度研究非诺贝特与甲基-β-环糊精的包合行为

邢雨霖,沈文康,王佳瑜,洪伟铭,张金基,艾凤伟*

(1.徐州医科大学 药学院,江苏 徐州 221004;2.江苏恩华药业股份有限公司药物研究院 江苏省中枢神经药物研究重点实验室,江苏 徐州 221000)

FNB是1975年首次上市的一个抗高脂血症药物,具有降低血液中胆固醇、甘油三酯、低密度和极低密度脂的作用,主要用于治疗高胆固醇血症、严重高甘油三酯血症和血脂异常[1]。然而,FNB属于生物制药分类系统(BCS)Ⅱ类化合物中典型的低溶解度药物,由于高亲脂性几乎完全不溶于水(logP=5.243),导致其通过上皮膜渗透性低而影响生物利用度[2-3]。因此,提高FNB的溶解度是扩展其治疗应用的关键。

提高低水溶性药物的生物利用度是当前制药行业面临的一个重要挑战,据统计,大约90%的新化学实体由于低溶解度而影响了临床应用[4]。一直以来,多种制剂技术和制剂手段被研究应用于提高难溶性药物的溶解度,如固体分散体、纳米制剂技术、微粉化和环糊精包合等,其中,环糊精具有提高药物溶解度、增强药物稳定性、降低刺激性等优良的药剂学特性,引起研究人员的极大关注[5]。环糊精是葡萄糖单体通过α-1,4糖苷键连接的锥形环状分子,具有亲水的外表面和疏水内空腔[6],常见的α,β和γ-环糊精由6,7,8个葡萄糖分子构成,直径分别为0.47,0.60 和 0.75 nm,不同直径的环糊精对装载的药物分子有特定的选择性。RMβCD是β-环糊精C2、C3、C8的羟基部分被甲基取代,具有更高的水溶性,在水中溶解度可以达到50%以上,生物体内相容性好,是理想的药物增溶载体材料[7-8]。

随着计算机技术和量子化学的发展,利用计算机模拟环糊精包合物的研究能更好地了解主客体分子的结合方式,在分子水平上探讨受体与客体分子相互作用以及结合过程的动态变化。目前,环糊精包合物文献的研究模式多是通过相溶解度法考察环糊精对药物的增溶作用,制备环糊精包合物并进行结构表征,环糊精包合机理和制备表征相结合方面的研究相对较少,因此,本研究采用相溶解度实验和分子模拟相结合的方法研究RMβCD和FNB的包合过程,探索FNB和RMβCD分子间的相互作用和包合机理,此研究方法有望为其他难溶性药物分子筛选环糊精载体材料提供一定的理论指导。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

SHA-B水浴振荡器(上海力辰仪器科技有限公司);ATY-124电子天平(岛津分析仪器有限公司);KQ-200KDE型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);UV-3100 pc紫外可见分光度计(上海美普达仪器有限公司)。

FNB(上海麦克林生化科技有限公司,含量99%);RMβCD(平均取代度=12,山东滨州智源生物科技有限公司);0.45 μm微孔过滤器(天津津腾);无水乙醇、溴化钾(国药集团化学试剂有限公司),纯净水。

1.2 方法

1.2.1 FNB紫外含量测定方法的建立

称取适量FNB,RMβCD分别配制成一定浓度溶液进行紫外全波长扫描,结果显示FNB在290 nm处有最大吸收,而RMβCD在290 nm处无明显紫外吸收,对FNB最大吸收无干扰,选择290 nm作为FNB紫外含量测定检测波长。

精密称取FNB 0.007 5 g,无水乙醇溶解定容于50 mL的量瓶中,精密移取上述FNB溶液10 mL置于100 mL量瓶中30%乙醇定容,得15 μg·mL-1的FNB储备液,分别移取1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0 mL于10 mL容量瓶中,30%乙醇溶液定容,在波长290 nm处测定吸光度。以吸光度(A)对浓度(C)作图, 得标准曲线方程为A=0.052 2C+0.029 9,R2=0.999 9。在1.5～15 μg·mL-1质量浓度范围内线性关系良好,方法学考察精密度、稳定性和回收率实验均符合要求。

1.2.2 相溶解度实验

配制0,2,4,6,8,10 mmol/L的RMβCD溶液10 mL于量瓶中,依次加入过量的FNB,置于恒温水浴振荡器在25,35,45 ℃条件下以100 r·min-1的转速振摇24 h使FNB和RMβCD充分结合,所得样品用0.45 μm微孔滤膜过滤,取滤液1.1 mL加入无水乙醇2 mL,30%的乙醇溶液适当稀释,紫外290 nm处测定吸光度,平行操作三次。根据标准曲线方程计算FNB浓度,以RMβCD浓度为横坐标,FNB浓度为纵坐标绘制相溶解度曲线,由公式(1) 计算不同温度下的包合稳定常数(KS),其中,S0为RMβCD浓度等于0时 FNB的溶解度,slope为相溶解度曲线的斜率。

KS=slope/[S0(1-slope)]

(1)

1.2.3 分子对接

β-CD(编号:762697)和FNB(编号:214632)的三维结构均来自剑桥晶体结构数据库(https://ccdc.cam.ac.uk/),RMβCD的结构是基于β-CD结构使用Avogadro软件进行绘制获得,RMβCD结构作为对接过程的受体,FNB作为配体,将配体FNB和受体RMβCD利用AutoDockTools-1.5.7进行去水和加全氢等预处理,使用 AutoDock-Vina进行半柔性分子对接[9],以整个RMβCD结构作为潜在的结合位点进行盲对接。对接坐标为x=21.0,y=15.0,z=15.0,选择自由结合能最低的构象使用 Pymol进行结果分析。

1.2.4 分子动力学模拟

2 结果与讨论

2.1 相溶解度

不同温度下的FNB-RMβCD相溶解度曲线如图1所示,可见FNB浓度随RMβCD浓度增加而增大,25,35,45 ℃下的相溶解度曲线方程分别为y=0.006 4x-0.006 2,y=0.009 2x-0.008 9和y=0.009 2x-0.008 9,曲线斜率小于1,根据Higuchi and Connors相溶解度曲线分类属于AL型,即 RMβCD与FNB按照物质的量比 1∶1形成包合物。三个温度下的包合稳定常数KS分别为4 969.90,5 833.21,7 141.07 L·mol-1,说明随着温度的升高包合稳定常数增大,越有利于包合物的生成,这可能与温度升高可以增加主客体分子在溶液中的无序分布,进而增加分子间接触机会从而有利于包合物的生成。

图1 FNB和RMβCD的相解度图

2.2 分子对接

(a)大口端正视图;(b)小口端正视图。

2.3 结构稳定性与结合构象

分子动力学模拟可验证分子对接结果的可靠性和形成包合物的动力学稳定性[13],均方根偏差(RMSD)是一种用于描述结构偏差的标准测量,有助于分析生物结构的时间依赖性运动,RMSD值的变化反映了模拟过程中受体与配体分子之间相互作用姿态的改变,RMSD在一定范围波动达到收敛时,可以认为分子的构型变化较小,结构达到稳定[14-15]。

图3为200 ns的模拟时间内包合物中主客体分子和包合物相对初始结构的RMSD动态变化图。图3(a)和(b)分别为FNB和RMβCD的RMSD图,在分子动力学模拟中FNB和RMβCD的RMSD均值分别为(0.193 3±0.040 2) nm和(0.146 8±0.028 8) nm,说明主客体分子结构的变化均在非常小的范围内,而包合物图3(c)的RMSD在0～20 ns的模拟时间内有一个从初始的0.15 nm增加到0.30 nm的变化,结合图3(d)不同模拟时间的包合物结合构象可知在0 ns时,FNB的芳香环已完全进入RMβCD疏水性空腔内, 15 ns时与甲酯基连接的芳香环已部分脱离RMβCD空腔,在后续150 ns的模拟时间里主要维持这样的结合构象,这可能是由于环糊精小口端的甲基基团与FNB分子的空间位阻所致,此外,RMβCD包合物在～25,～60,～90,～130 ns和显示出更大的偏离收敛轨迹的现象,这些偏差表明包合物的多种不同稳定构象可能是FNB分子在RMβCD结构空腔内的重新取向。整个200 ns模拟中包合物的RMSD均值为(0.291 9±0.077 1) nm,可能是由于FNB和RMβCD形成了更大空间结构的包合物结构体,而且FNB分子在RMβCD在空腔中的位置和结构动态变化对两者的构象有一定程度的影响,所以包合物的RMSD较自由的FNB和RMβCD单体都有增加。然而,FNB-RMβCD包合物和主、客体分子RMSD波动幅度都在较小的范围内,说明模拟过程中结构已达稳定状态。

(a)FNB;(b)RMβCD;(c)FNB-RMβCD;(d)不同时间的结合构象。

2.4 FNB-RMβCD结合能自由能分析

模拟体系结合自由能的变化直接反映了主客体分子间相互作用的大小[16]。FNB和RMβCD之间的相互作用自由能通过分子力学泊松-玻尔兹曼表面积(MM-PBSA)将熵贡献、构象波动与MD模拟数据相结合计算。根据RMSD分析结果选择结构完全稳定的180～200 ns时间的模拟数据进行结合自由能分析,结果如图4所示。

(a)结合自由能;(b)组成图。

FNB和RMβCD的结合自由能(图4a)为(-12.76 ±1.84) kcal/mol,结合自由能为负值说明包合过程为非外力驱动的自发过程,结合自由能数值越小,结合力越强,在180～200 ns的模拟时间内的结合自由能呈规律性的小范围波动,说明模拟结合构象达到稳定状态;MM-PBSA将结合自由能拆分成分子力学项(GGAS)和溶剂化能(GSOLV),其中GGAS包括范德华能量项(VDWAALS)和静电能量项 (EEL),而GSOLV又分为极性溶剂化能(EPB)和非极性溶剂化能(ENPOLAR)。图4b所示为FNB和RMβCD的结合自由能组成,GGAS是结合自由能的主要贡献者,反映出主客体分子间强烈的相互作用,GGAS中范德华力起到关键的作用,静电力作用相对较小,而GSOLV对结合自由能呈负面作用,说明溶剂化不利于主客体分子的结合。

3 结论

首先,在 25,35,45 ℃的相溶解度实验中,FNB 的溶解度随RMβCD浓度的增加而呈线性的增大,不同温度下相溶解度曲线均为 AL型,斜率小于1,表明FNB与RMβCD按1∶1的物质的量比形成包合物,三个温度下的包合稳定常数分别为4 969.90,5 833.21,7 141.07 L·mol-1,提示随着温度的升高有利于包合物的形成,可能升高温度增加了FNB和RMβCD分子的无序运动而促使包合物的生成。