循环血微小RNA-132和微小RNA-195在慢性阻塞性肺疾病相关肺动脉高压患者中的表达及意义

朱殷慧 蔡茜 杨密

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是因肺泡和(或)气道异常而发生的以气流受限和持续呼吸道症状为特征的一种疾病,常因长期暴露于有害气体或颗粒中所致[1]。COPD发病率呈逐年增长,而肺动脉高压(PH)是其常见并发症[2],其中50%～60% COPD会继发PH[3]。右心导管检查是诊断PH的金标准,但该方法操作复杂,并存在潜在并发症。因此,寻找COPD相关PH诊断的新指标日益受到重视。微小RNA(miRNA,miR)是近年来的研究热点,参与肿瘤、免疫及炎症等多种疾病的发病过程[4-6]。研究发现,多种miRNA在COPD中异常表达[7]。miR-132和miR-195是重要的miRNA,研究发现其参与呼吸系统疾病的诸多过程[8]。基于此,本研究主要探讨循环血miR-132和miR-195在COPD相关PH患者中的表达及意义。

对象与方法

1.对象:纳入2020年9月～2022年2月于我院就诊的COPD相关PH患者108例作为观察组,其中男63例,女45例,年龄45～74岁,平均年龄(64.87±6.92)岁,平均BMI(22.31±2.87)kg/m2;吸烟史46例;高血压24例,糖尿病20例。另纳入同期于我院就诊的COPD但无COPD相关PH患者97例作为对照组,其中男58例,女39例,年龄42～75岁,平均年龄(65.07±5.62)岁,平均BMI(22.16±3.25)kg/m2;吸烟史42例;高血压20例,糖尿病15例。两组一般资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)。COPD的诊断参照《慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2021年修订版)》[9];PH的诊断参照欧洲呼吸学会和欧洲心脏病学会联合制定的关于PH的诊断标准[10]。排除标准:(1)伴间质性肺疾病、支气管扩张及支气管哮喘;(2)伴肺炎或其他部位急性感染;(3)伴心脏瓣膜病、先天性心脏病、肺栓塞及特发性PH引起的PH;(4)严重精神疾病;(5)近3个月有手术史;(6)肝肾功能不全。本研究经我院伦理委员会审核批准,所有患者均签署知情同意书。

2.方法

(1)循环血miR-132和miR-195相对表达水平检测:抽取患者外周静脉血6 ml,置于肝素钠抗凝管中,混匀备用,外周血单个核细胞(PBMC)以Ficoll淋巴细胞分离液提取。PBMC总RNA按照Trizol试剂(昆山远慕生物科技有限公司)说明书提取,再以焦碳酸二乙酯处理过的蒸馏水溶解。采用分光光度仪测定总RNA浓度和质量。采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反转录成互补DNA,逆转录产物置于-70 ℃冰箱待用。采用SYBR法进行实时荧光定量定量PCR(qRT-PCR)检测。引物由上海生工生物工程有限公司合成,见表1。总反应体系20 μl:包括10 μl RNase-free H2O、2.0 μl cDNA、0.4μl PCR reverse primer、0.4 μl DYE I、0.4 μl PCR forward primer、6.8 μl SYBER GREEN,将上述物质混匀后行qRT-PCR扩增。反应条件:95 ℃预变性10 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min,共40个循环,每个样品设置3个复孔,以U6作为内参。采用2-△△Ct法计算miR-132和miR-195相对表达水平,△CT=CT目的基因-CTU6;△△CT=△CT观察组-△CT对照组。

表1 引物序列

(2)肺功能测定:采用德国耶格肺功能仪测定第1秒用力呼气容积(FEV1)/用力呼气容积(FVC)、FEV1占预计值的百分比(FEV1%)。

(3)肺动脉压测定:采用三尖瓣最大反流流速估测右心室收缩压(RVSP),在无右心室流出道梗阻且无心内分流时,RVSP近似于肺动脉收缩压(sPAP)。sPAP=RVSP=4VTR(三尖瓣反流最大速度)+右心房压力(RAP)。

结 果

1.两组患者临床资料比较:观察组患者循环血miR-132相对表达水平及sPAP均高于对照组,循环血miR-195相对表达水平及FEV1%、FEV1/FVC均低于对照组(P<0.001)。见表2。

表2 两组患者临床资料比较

2.循环血miR-132和miR-195对COPD相关PH的预测价值:ROC曲线分析结果显示,循环血miR-132预测COPD相关PH的ROC曲线下面积(AUC)为0.894(95%CI0.863～0.947),最佳截断值为1.98,对应的敏感度和特异度分别为77.81%、82.63%;循环血miR-195预测COPD相关PH的AUC为0.912(95%CI0.882～0.955),最佳截断值为0.65,对应的敏感度和特异度分别为83.31%、78.72%。

3.COPD相关PH患者循环血miR-132和miR-195与FEV1%、FEV1/FVC及sPAP的相关性:Pearson相关分析结果显示,COPD相关PH患者循环血miR-132与FEV1%、FEV1/FVC均呈负相关(r=-0.517,P<0.001;r=-0.628,P<0.001),与sPAP呈正相关(r=0.564,P<0.001);COPD相关PH患者循环血miR-195与FEV1%、FEV1/FVC均呈正相关(r=0.586,r=0.521,P均<0.001),与sPAP呈负相关(r=-0.507,P<0.001)。

4.COPD相关PH的影响因素分析:多元logistic回归分析结果显示,循环血miR-132和miR-195均为COPD相关PH的独立危险因素(P<0.05)。见表3。

表3 COPD相关PH影响因素的多元logistic回归分析

讨 论

COPD是一种慢性气道疾病,其患病率逐渐上升,且存在较高的致死率[11]。而PH是COPD的重要并发症之一,研究发现PH是促使COPD进展至肺心病的重要环节[12]。当COPD造成气道阻塞,则会使肺血管和肺实质受到损害,致使肺小动脉管壁增厚、纤维化或管腔狭窄,从而导致肺血管阻力增加,以此造成PH发生及肺循环血管重塑[13]。由于COPD相关PH是不可逆的病理变化,长期低氧造成低氧性肺血管收缩,血管舒张因子分泌紊乱,肺血管平滑肌细胞和内皮细胞增殖,以此形成不可逆的肺血管重构,恶性循环进而引起PH[14-15]。COPD相关PH发病机制尚未完全明确,包括环境因素、表观遗传因素等,各种类型PH存在一些共同的病理改变,如肺动脉平滑肌细胞增殖与迁移、肺动脉内皮细胞损伤等[16-17]。及时有效地准确评估COPD相关PH尤为关键。

miRNA在多种组织和器官中广泛表达,参与肿瘤迁移和侵袭等病理生理过程,并且在多种疾病发生、发展中具有重要意义。近年来研究发现,miRNA异常表达与PH发病关系紧密,并在PH血管重构中发挥重要作用[18]。多种miRNA在炎症性肺疾病中异常表达,并发现其作用的靶点,参与了炎症、免疫的调节。持续性慢性炎症可造成某些miRNA表达失调、组织重建和修复,进而导致PH形成。miR-132主要通过抑制沉默信息调节因子1发挥促炎作用。miR-195不仅参与细胞缺氧的调控,并且参与机体固有免疫的调节。本研究结果显示,观察组患者循环血miR-132相对表达水平高于对照组,miR-195相对表达水平低于对照组;循环血miR-132预测COPD相关PH的敏感度和特异度分别为77.81%、82.63%,循环血miR-195预测COPD相关PH的敏感度和特异度分别为83.31%、78.72%;COPD相关PH患者循环血miR-132与FEV1%、FEV1/FVC均呈负相关,与sPAP呈正相关,COPD相关PH患者循环血miR-195与FEV1%、FEV1/FVC均呈正相关,与sPAP呈负相关;循环血miR-132和miR-195为COPD相关PH的独立危险因素,表明COPD相关PH患者循环血miR-132呈高表达而miR-195呈低表达,循环血miR-132和miR-195对COPD相关PH的预测价值良好,COPD相关PH患者循环血miR-132与肺功能呈负相关而与sPAP呈正相关,而COPD相关PH循环血miR-195与肺功能呈正相关而与sPAP呈负相关,由此可见循环血miR-132和miR-195与COPD相关PH密切相关,且与肺功能密切相关,但其具体作用机制尚未完全明确,还需后续研究增加样本量和观察时间并进行多中心研究进一步证实,以期为临床提供可靠参考依据。

综上所述,COPD相关PH患者循环血miR-132呈高表达,而循环血miR-195呈低表达,且循环血miR-132和miR-195对COPD相关PH的预测价值良好,为COPD相关PH的独立危险因素。