替罗非班对急性缺血性卒中小鼠的神经保护作用

满旭 韩滨 汪青青 孙锦平

［收稿日期］2023-06-01;  ［修訂日期］2023-08-21

［基金项目］国家重点研发计划项目（2018YFC1315200）；山东省自然科学基金项目（ZR2020QH099）

［第一作者］满旭（1995-），女，硕士研究生。

［通信作者］孙锦平（1969-），女，博士，主任医师，博士生导师。E-mail：sunjinping@qdu.edu.cn。

［摘要］  目的

探讨替罗非班对急性缺血性卒中（AIS）小鼠脑梗死体积及神经元凋亡的影响。

方法  将65只雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术组、模型组及替罗非班低、中、高剂量组，每组13只。采用光化学脑卒中法建立小鼠脑缺血模型。模型组尾静脉注射相同体积的生理盐水，替罗非班各剂量组尾静脉注射不同剂量的替罗非班。采用神经行为学评分（mNSS评分）评估小鼠神经功能缺损，2，3，5氯化三苯基四氮唑（TTC）测定小鼠脑梗死体积，TUNEL染色与NeuN染色检测小鼠神经元凋亡情况。

结果  5组的mNSS评分、脑梗死体积、TUNEL阳性细胞数量和NeuN阳性细胞数量差异有统计学意义（F=9.630～124.927，P<0.05）。与模型组相比，替罗非班中剂量组神经行为损伤明显改善、脑梗死体积下降、TUNEL阳性细胞数量减少、NeuN阳性细胞数量增加，差异均有统计学意义（P<0.05）。

结论  中剂量替罗非班可降低AIS小鼠神经功能缺损评分、减小脑梗死体积及减轻神经元凋亡，从而发挥神经保护作用。

［关键词］  替罗非班；缺血性脑卒中；神经行为学表现；脑梗死；神经细胞凋亡抑制蛋白

［中图分类号］  R972.7;R743.3

［文献标志码］  A

［文章编号］  2096-5532（2024）01-0017-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.021

［开放科学（资源服务）标识码（OSID）］

［网络出版］  https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240319.1459.004;2024-03-21  17：37：49

Neuroprotective effects of tirofiban in mice with acute ischemic stroke

＼ MAN Xu， HAN Bin， WANG Qingqing， SUN Jinping

（Center for Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Department of Medicine， Qingdao University， Qingdao 266021， China）

＼; ［Abstract］＼ Objective＼ To investigate the effects of tirofiban on brain infarct volume and neuronal apoptosis in mice with acute ischemic stroke （AIS）.

＼ Methods＼ Sixty-five C57BL/6 mice were randomly divided into sham group， model group， and low-dose， medium-dose， and high-dose tirofiban groups， with 13 mice in each group. Amouse model of cerebral ischemia was established through photochemical thrombosis. The model group received injection of the same volume of normal saline via the tail vein， while the tirofiban groups receivedinjection of different doses of tirofiban into the tail vein.The neurological deficits of mice were evaluated using the modified neurological severity scale （mNSS）.The brain infarct volume was measuredwith 2， 3， 5-triphenyltetrazolium chloride staining. Neuronal apoptosis was determined with TUNEL staining and NeuN staining.

＼ Results＼ There were significant differences in the mNSS score， cerebral infarction volume， the number of TUNEL-positive cells， and the number of NeuN-positive cells between the five groups （F=9.630-124.927，P<0.05）. Compared with the model group， the medium-dose tirofiban group showed significantly resolved neurobehavioral damage， a significantly decreased cerebral infarction volume， a signi-

ficantly decreased number of TUNEL-positive cells， and a significantly increased number of NeuN-positive cells （P<0.05）.

＼ Conclusion＼ A medium dose of tirofiban can play a neuroprotective role in mice with AIS， decreasing neurological deficit score， infarct volume，and neuronal apoptosis.

［Key words］＼ tirofiban; ischemic stroke; neurobehavioral manifestations; brain infarction; neuronal apoptosis-inhibitory protein

急性缺血性卒中（AIS）病人约占所有卒中的80%［1］。AIS的病理过程涉及炎症、细胞凋亡和神经元损伤［2］。对于AIS病人，在发病后4.5 h内，静脉溶栓是标准治疗方法［3］，可改善临床预后并降低死亡率［4］。目前针对AIS的治疗方法十分有限，迫切需要开发新疗法。AIS治疗的主要目标是保护正常脑组织，促进梗死区附近缺血半暗带区域的功能恢复［5］。有研究表明，抗血小板药物的使用对于AIS治疗是必要的［6-7］。替罗非班是一种半衰期短的速效糖蛋白（GP）Ⅱb/Ⅲa抑制剂，可通过可逆阻断纤维蛋白结合受体来抑制血小板聚集的最终共同途径［8］。替罗非班在未接受早期再通治疗的AIS病人中是安全有效的［9］。本研究探讨不同剂量替罗非班對小鼠脑梗死体积以及缺血半暗带区神经元凋亡的影响，为替罗非班用于AIS病人提供依据。现报告如下。

1  材料与方法

1.1  实验材料

雄性C57BL/6小鼠65只，体质量为（26±2）g，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供。2，3，5氯化三苯基四氮唑（TTC）购自美国Sigma公司。TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。NeuN抗体购自英国Abcam公司。驴抗兔IgG二抗购自美国Thermo Scientific公司。40 g/L多聚甲醛购自北京索莱宝科技有限公司。盐酸替罗非班氯化钠注射液由鲁南贝特制药有限公司提供。制备光化学模型所需光纤冷光源仪器购自德国Schott公司。冷冻超薄切片机购自德国Leica公司。荧光显微镜购自日本Olympus公司。

1.2  实验方法

1.2.1  光化学卒中模型制备及实验分组  采用光化学方法诱导血栓形成脑缺血模型［10］。将所有小鼠随机分为假手术组、模型组、替罗非班低剂量组（2.5 mg/kg）、替罗非班中剂量组（7.5 mg/kg）和替罗非班高剂量组（12.5 mg/kg），每组13只。光化学卒中模型建立后，假手术组注射孟加拉玫瑰红后不光照，其余手术步骤同模型组。模型组小鼠尾静脉注射相应体积的生理盐水，其余各组小鼠分别尾静脉注射低、中、高剂量替罗非班。24 h后，每组随机选取10只小鼠进行神经行为学评分（mNSS评分），之后处死小鼠，测量脑梗死体积。随后，每组取剩余的3只小鼠进行冷冻切片标本采集，进行免疫荧光实验。

1.2.2  mNSS评分  mNSS评分范围为0～18分，内容主要包括运动测试、感觉测试、平衡木测试和反射测试［10］。mNSS评分越高，表示神经系统损伤越严重。

1.2.3  脑梗死体积的测定  在光化学所致的脑缺血模型形成后24 h后采用TTC染色法对小鼠脑组织进行染色。白色区域的体积即为脑梗死体积。具体步骤如下：腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠，去除小鼠颅骨后，取出脑组织放置在载玻片上，之后迅速置于-20 ℃冰箱中速冻10 min。将冷冻过的脑组织取出，沿冠状面切成约2 mm厚的脑片。将切片置于20 g/L TTC溶液中，37 ℃下避光孵育30 min。切片每5 min翻转一次，最后将染色完成后的脑片放置在40 g/L多聚甲醛中固定1 h，将固定好的脑片旁边放置直尺，并进行拍照。利用Image-Pro-Plus软件对梗死区域进行体积的测量，计算脑梗死体积比例。脑梗死体积比例=（总梗死体积/各脑切片体积之和）×100%。

1.2.4  TUNEL法检测小鼠脑缺血半暗带区凋亡细胞数  光化学致脑缺血模型建立成功后24 h，麻醉小鼠后分离脑组织，脑组织在40 g/L多聚甲醛中固定24 h，将脑组织转移到含有150 g/L蔗糖水的离心管中进行脱水，待脑组织沉入到离心管管底后，将脑组织转移到含有300 g/L蔗糖水的离心管中进行进一步脱水，直至脑组织沉入管底，进行下一步包埋。脱水后的脑组织嵌入OCT包埋，干冰快速冷冻后，使用温度为-20 ℃的冷冻切片机将脑组织沿冠状面切成厚度为8 μm的脑片，之后用40 g/L多聚甲醛固定脑片30 min，磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗涤2次，每次10 min。加入含体积分数0.005聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）的PBS，待破膜完毕后，将脑片用PBS清洗3次。使用TUNEL检测试剂盒进行TUNEL测定。加入50 μL TUNEL反应混合物（5 μL TdT酶溶液和45 μL标记溶液），并将所得混合物在黑暗潮湿的环境中在37 ℃下孵育1 h。用PBS洗涤3次。最后，细胞核使用4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色。用荧光显微镜观察呈现绿色的凋亡细胞。

1.2.5  免疫荧光染色方法检测小鼠脑缺血半暗带区NeuN的表达  将-20 ℃冰箱中的脑冷冻切片复温至室温，多聚甲醛固定10 min，磷酸盐吐温缓冲液洗3次，每次5 min。之后利用体积分数0.003 Triton X-100室温通透10 min，破膜完毕后，将脑片清洗3次。用PBS配制30 g/L的牛血清清蛋白进行室温封闭1 h。封闭完成后，加入NeuN一抗（1∶500），并置于4 ℃的冰箱中孵育过夜。一抗孵育完毕之后，用PBS清洗3次，每次5 min。加入荧光二抗（1∶500）后室温避光孵育40 min。二抗孵育完成后，加入DAPI染色，抽选3个荧光显微镜下的视野进行图像分析并计算NeuN阳性细胞数。

1.3  统计学处理

应用Graph Pad Prism 9.0软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，多组数据组间均数的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Bonferroni检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2  结  果

2.1  各组小鼠mNSS评分比较

mNSS评分结果显示，5组小鼠mNSS评分差异有统计学意义（F=97.234，P<0.05）。与假手术组相比，模型组小鼠出现神经功能损伤（P＜0.05）；与模型组相比，替罗非班中剂量组小鼠神经行为功能损伤减轻（P＜0.05）。见表1。

2.2  各组小鼠脑梗死体积比较

TTC染色结果显示，5组小鼠脑梗死体积差异有统计学意义（F=43.080，P<0.01），与模型组相比，替罗非班中剂量组小鼠脑梗死体积减小（P＜0.05）。见图1和表1。

2.3  各组小鼠缺血半暗带区TUNEL阳性细胞数比较

凋亡染色结果显示，5组小鼠缺血半暗带区的TUNEL阳性细胞数差异具有统计学意义（F=124.927，P<0.05）。与假手术组相比较，模型组

小鼠缺血半暗带区的TUNEL阳性细胞数上升（P＜0.05）；

与模型组相比，替罗非班中剂量组的TUNEL阳性细胞数减少（P＜0.05）。见图2和表1。

2.4  各组小鼠缺血半暗带区NeuN阳性细胞数的比较

免疫荧光结果显示，5组小鼠缺血半暗带区NeuN阳性细胞数差异有统计学意义（F=9.630，P<0.05）。与假手术组相比，模型组、低剂量替罗非班组小鼠缺血半暗带区NeuN阳性细胞数显著下降（P＜0.05）；与模型组相比，替罗非班中剂量组的NeuN阳性细胞数显著上升（P＜0.05）。见图3和表1。

3  讨  论

本研究结果显示，替罗非班可减少脑梗死体积和神经元凋亡，改善AIS小鼠神经功能缺损。表明替罗非班可以保护AIS后带来的神经损伤，为替罗非班在AIS中的作用提供了新的见解。

替罗非班是一种高度特异性的非肽类血小板放大400倍，标尺=100 μm。

GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂，可有效阻断血小板活化和

聚集的共同途径［11］。在脑卒中相关治疗中，给予GPⅡb/Ⅲa抑制剂可能是安全的，但是应该注意药物种

类和剂量［12-13］。阿昔单抗可以增加症状性颅内出血的风险，替罗非班在低剂量下可以被认为是安全的［14］。

与常见的双重抗血小板治疗相比较，替罗非班单药治疗AIS是安全的［15］，替罗非班治疗作为未接受再通治疗的AIS病人的补救治疗，是安全有效的［16-17］。替罗非班可能是AIS治疗潜在的安全选择［18］。

有研究表明，替罗非班在大脑中动脉阻塞24 h后可以减小小鼠脑梗死体积，但对小鼠神经功能障碍无明显影响［19］。而本研究结果显示，7.5 mg/kg的替罗非班不仅可减小小鼠脑梗死体积，也降低了小鼠神经功能障碍。脑卒中发生后，主要引起神经细胞凋亡及機体炎症反应。NeuN被认为是一种成熟神经元标志物，是脑卒中研究中极其重要的一个指标［20］。本研究结果显示，替罗非班中剂量组小鼠NeuN阳性细胞数明显上升。表明替罗非班通过降低梗死体积、减轻神经功能损伤以及减少缺血半暗带区NeuN阳性神经元的丢失，在AIS中发挥神经保护作用［21］。

本研究还发现，较高剂量（12.5 mg/kg）替罗非班可能导致更大的脑梗死体积。有学者提出了双相剂量反应和激效的概念，即在低剂量刺激下具有有益作用，高剂量会导致抑制甚至毒性效应［22-23］。推测高剂量下脑梗死体积的增加可能与双相剂量反应和激效有关。

综上所述，本研究在动物水平观察了不同剂量

替罗非班对AIS小鼠的神经保护作用。替罗非班放大400倍，标尺=100 μm。

可通过减少脑梗死体积以及减轻缺血半暗带区神经

元凋亡来发挥神经保护作用。本研究未能进一步检

测凋亡相关蛋白的变化趋势，也未涉及替罗非班发

挥神经保护作用的具体的分子机制及相关通路。这些内容我们将在后续研究中进行进一步的探讨。

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（本文編辑  周晓彬）

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