MicroRNA 的生物表达与结核病诊断和治疗监测的相关性及其对结核病易感基因表达调控的研究

谭珂 于艳红 孙娇 孙秀华 王悦 贾琳 邢黎莉 张威

肺结核是一种临床上比较常见的传染病, 是感染结核分枝杆菌诱发的, 患者的感染几率和死亡几率较高。研究发现, 肺结核患者血浆hsa-miR-20b 的表达量较高, 故可以提示患有肺结核的可靠参照物［1］。同时, 当患者感染结核杆菌时免疫细胞会分泌许多的炎性因子, 故也可以辅助诊断肺结核, 同时炎性反应还可以提示结核病的恶化及转归［2］。此次试验的目的是探究MicroRNA 对结核患者诊断和治疗监测及易感基因表达调控的意义, 为诊治肺结核提供帮助。现将详细过程报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2021 年6 月～2022 年11 月沈阳市第十人民医院136 例肺结核患者作为肺结核组, 并选择同时间段内同一医院142 例健康体检者作为对照组。肺结核组中男76 例, 女60 例；年龄31～52 岁, 平均年龄(43.8±5.6)岁。对照组中男78 例, 女64 例；年龄34～54 岁, 平均年龄(42.1±4.8)岁。两组一般资料无统计学意义(P＞0.05), 具有可比性。

1.2 纳入标准 ①满足《肺结核诊断和治疗指南》［3］中关于诊断肺结核的标准；②患者自愿参与相关试验项目, 并签署知情同意书。

1.3 排除标准 ①患有严重的肝肾功能障碍；②对试验药物过敏；③患有糖尿病、肿瘤等疾病；④患有严重的急性心脑血管疾病；⑤妊娠期及哺乳期；⑥患有精神性疾病或不能配合试验；⑦近期使用糖皮质激素、抗感染、免疫等影响炎症反应的药物。

1.4 方法

1.4.1 样本收集 肺结核患者在住院第2 天采集静脉血, 同时收集健康体检者的静脉血, 用3500 r/min 的速度离心3 min, 提取上清液, 保持在-80℃的环境中。

1.4.2 检测hsa-miR-20b、CUL4A mRNA、GBP5 mRNA表达量 提取标本后, 在无菌环境下操作, 通过BIOG血清miRNA 提取试剂法收集总RNA, 具体操作按BIOG血浆血清miRNA 提取试剂(常州百代生物科技股份有限公司)说明书进行。以紫外分光光度计(Nano EX,泽尼萨尔有限公司)检测RNA 浓度、纯度, 并验其完整性。根据BIOG miRNA 探针法逆转录试剂盒(常州百代生物科技股份有限公司)说明书将RNA 逆录成cDNA。利用BIOG miRNA 探针法荧光定量PCR 试剂(常州百代生物科技股份有限公司)及PCR 仪(Rotor-Gene Q, 凯杰企业管理有限公司)将cDNA 扩增, qPCR检测。hsa-miR-20b、CUL4A mRNA、GBP5 mRNA 以hsa-miR-16 为 内 参。以2-ΔΔCt法 计 算hsa-miR-20b、CUL4A mRNA、GBP5 mRNA 相对表达量。

1.4.3 检测血清IRF8、hsa-circRNA-103571、IFN-γ水平 提取出样本后, 用人IRF8 酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(KHG0111, 上海研卉生物科技有限公司)、hsa-circRNA-103571(ELISA) 试剂盒(OSD_H0170, 长沙达尔锋生物科技有限公司)、IFN-γ(ELISA)试剂盒(BS-E3748 h1, 广州徕智生物科技有限公司), 通过ELISA 法对IRF8、hsa-circRNA-103571、IFN-γ 水平进行检测。

1.5 统计学方法 数据通过SPSS22.0 软件进行统计。计量资料以均数±标准差 (±s)表示, 采用t 检验；计数资料以率(%)表示, 采用χ2检验。肺结核患者的hsa-miR-20b 与IRF8、hsa-circRNA-103571、IFN-γ的相关性检验采用Pearson 相关进行；采用Logistic 回归分析肺结核发生的危险因素；采用受试者工作特征曲线(ROC 曲线)分析hsa-miR-20b 的表达量对肺结核的诊断效能。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清hsa-miR-20b、GBP5 mRNA、CUL4A mRNA 的表达量比较 与对照组相比, 肺结核组患者血清hsa-miR-20b、GBP5 mRNA 的表达水平均升高,CUL4A mRNA 的表达水平降低, 差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 两组血清hsa-miR-20b、GBP5 mRNA、CUL4A mRNA 的表达量比较( ±s)

表1 两组血清hsa-miR-20b、GBP5 mRNA、CUL4A mRNA 的表达量比较( ±s)

注：与对照组比较, aP＜0.05

组别 例数 hsa-miR-20b GBP5 mRNA CUL4A mRNA肺结核组 136 3.35±0.20a 2.94±0.23a 0.41±0.15a对照组 142 1.01±0.23 1.02±0.13 1.03±0.11 t 90.357 86.145 39.417 P 0.000 0.000 0.000

2.2 两组血清IRF8、hsa-ciceRNA-103571、IFN-γ水平比较 与对照组相比, 肺结核组患者血清IRF8、hsa-circRNA-103571 水平较高, IFN-γ 水平明显较低,差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 两组血清IRF8、hsa-ciceRNA-103571、IFN-γ 水平比较( ±s)

表2 两组血清IRF8、hsa-ciceRNA-103571、IFN-γ 水平比较( ±s)

注：与对照组比较, aP＜0.05

组别 例数 IRF8(pg/ml) hsa-circRNA-103571(ng/L) IFN-γ(pg/ml)肺结核组 136 389.39±46.85a 22.48±5.06a 5.58±1.36a对照组 142 327.62±41.76 11.36±3.17 12.72±4.78 t 11.616 22.056 17.093 P 0.000 0.000 0.000

2.3 肺结核患者hsa-miR-20b 与IRF8、hsa-circRNA-103571、IFN-γ 的相关性分析 Pearson 相关性分析显示, 肺结核患者血清hsa-miR-20b 与IRF8、hsacircRNA-103571 水平呈正相关(r=0.585、0.539, P＜0.05),与IFN-γ 水平呈负相关(r=-0.485, P＜0.05)。

2.4 肺结核发生的影响因素分析 以hsa-miR-20b、IRF8、hsa-circRNA-103571、IFN-γ 水平为自变量,以肺结核是否发生为因变量, 行Logistic 回归分析, 结果 显 示hsa-miR-20b、IRF8、hsa-circRNA-103571 是肺结核发生的危险因素(P＜0.05), IFN-γ 是肺结核发生的保护因素(P＜0.05)。见表3。

表3 肺结核发生的影响因素分析

2.5 血清hsa-miR-20b 水平对肺结核的诊断效能分析 ROC 曲线显示, 血清hsa-miR-20b 水平对肺结核发生诊断的曲线下面积(area under curve, AUC)为0.898［95%CI=(0.860, 0.936)］, 截断值为1.44, 其灵敏度、特异度分别为83.82%、88.03%。见图1。

图1 血清hsa-miR-20b 水平对肺结核的诊断效能

3 讨论

miRNA 是大量存在于人体血液中的小RNA, 并且不参与生物编码, 在人体新陈代谢等生命活动中都有参与, 所以肺结核等肺部疾病患者其水平会显著升高。经Ndzi 等［4］试验证实, 当发生肺结核时hsa-miR-20b会出现异常的表达。既往研究显示, CUL4A 在肺结核患者的表达中会出现差错, 其表现贯彻整个疾病的演变过程［5-9］。此次试验证实, 肺结核患者的hsa-miR-20b 表达显著高于健康人群, 同时CUL4A mRNA 的表达出现下降, 证明hsa-miR-20b 表达上升和CUL4A 表达下降可以预示肺结核的出现和恶化。在肺结核的恶化进程中, 免疫因子都有相应的参与, 其中, IRF8 作为一种重要的细胞因子, 在细胞的分化和发育中起重要作用［10-14］。circRNAs 是一类由3'端反向与5'端连接形成共价闭环结构的新型内源性RNA, 随着对研究的不断深入, 发现circRNAs 具有与常规线性RNA 不同的生物学特性, 包括广泛性、高度保守性、高稳定性以及组织特异性［15-19］。此外, IFN-γ 可激活免疫细胞, 在抗结核过程中发挥重要作用, 肺结核患者血清中IRF8、hsa-circRNA-103571 水平升高, IFN-γ 水平降低。相关研究［20］中, 经结核药联合利福喷丁治疗后,IRF8、hsa-circRNA-103571 水平降低, IFN-γ 水平升高, IRF8、hsa-circRNA-103571、IFN-γ 均可能参与且影响肺结核发病进展。本研究中肺结核组患者血清IRF8、hsa-ciceRNA-103571 水平均明显高于对照组,IFN-γ 水平明显低于对照组(P＜0.05)；由此提示炎症相关因子IRF8、hsa-circRNA-103571、IFN-γ 可能在肺结核发病过程中起一定作用。本研究中肺结核患者血清hsa-miR-20b 与IRF8、hsa-circRNA-103571 水平呈正相关(r=0.585、0.539, P＜0.05), 与IFN-γ 水平呈负相关(r=-0.485, P＜0.05)；由此提示hsa-miR-20b 可能与IRF8、hsa-circRNA-103571、IFN-γ 等因素关系密切, 可以对肺结核的演化进行干预。本研究结果显示, hsa-miR-20b、IRF8、hsa-circRNA-103571 是肺结核发生的危险因素, IFN-γ 是肺结核发生的保护因素,提示hsa-miR-20b、IRF8、hsa-circRNA-103571 水平升高、IFN-γ 水平降低均可能使肺结核患病风险升高,及时监测hsa-miR-20b、IRF8、hsa-circRNA-103571、IFN-γ 浓度可以提早发现肺结核。

综上所述, 肺结核患者血清hsa-miR-20b 表达上调, hsa-miR-20b 与炎症相关因子具有一定相关性, 其可能与炎症因子共同影响肺结核疾病病变过程。