舒脉胶囊干预大鼠髂动脉球囊损伤后的炎症作用机制

郭 卉 吕春燕 焦琳茜 谢书睿 徐旭英

下肢动脉硬化闭塞症(arteriosclerosis obliterans,ASO)是常见的周围血管病之一,该病是由于下肢动脉粥样硬化斑块形成导致血管内膜增厚、管腔狭窄或闭塞使得肢体供血不足而发生病变的一种疾病。ASO影响着全球超过2.3亿成年人,是一个全球性的公共卫生问题[1]。其带来的各种伤害严重影响了患者的生活质量,尤其是对身体功能的伤害,除此之外ASO高额的医疗费用对于患者来说更是雪上加霜[2]。介入术破环了血管原有的结构,导致新的理化反应,造成介入术后再狭窄的发生,其成因与内膜增生、血管弹力回缩、血栓形成和炎性反应息息相关[3]。其中核因子-κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)是启动炎性反应的关键因子,通过抑制NF-κB的活性来减少白细胞介素-6(interlenkin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α的产生,降低炎性反应[4,5]。前期研究表明舒脉胶囊能有效抑制大鼠髂动脉球囊损伤后血管内膜的增生,降低介入术后再狭窄发生的风险,然而其是否通过干预炎性反应以达到抑制血管内膜增生的目的尚未得到验证[6, 7]。本研究采用大鼠髂动脉球囊损伤模型,探讨舒脉胶囊干预大鼠髂动脉球囊损伤后的炎症作用。

材料与方法

1.实验动物:所有动物实验和程序均经首都医科大学附属北京中医医院动物保护伦理学委员会批准(BJTCM-R-2021-11-02)。选取SPF级6周龄健康雄性SD大鼠18只,由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供,体质量为200±20g,饲养于SPF级动物室,温度23～26℃,日温差≤3℃,相对湿度40%～70%,房间空气压差梯度20～50Pa,12h明暗交替饲养,常规正常饮食,适应性饲养7天。动物生产许可证编号:SCXK(京)2019-0010。

2.药物与试剂:舒脉胶囊(京药制字Z20053323; 批号 2141201),主要成分:鸡血藤、当归、黄芪、丹参、枸杞子、首乌藤、川芎、山楂、制水蛭、山药、陈皮、泽泻、石菖蒲、玄参等,胶囊含原药材0.4克/粒。肝素钠购自北京索莱宝科技有限公司,注射用青霉素钠购自山西省芮城县红宝兽药有限责任公司,硫酸庆大霉素注射液购自上海全宇生物科技(驻马店)动物药业有限公司,戊巴比妥钠购自美国Sigma公司,生理氯化钠溶液购自四川科伦药业股份有限公司,4%多聚甲醛购自兰杰柯科技有限公司。

3.仪器:1.5mm×15.0mm球囊购自广东博迈医疗科技股份有限公司,指引导丝购自美国Boston Science公司,8-0非吸收性外科缝线和5-0非吸收性外科缝线均购自扬州富达医疗器械有限公司。石蜡包埋机、HistoCore MULTICUT切片机、全自动染色机、正置显微镜和扫片仪均购自德国Leica公司。

4.大鼠髂动脉球囊损伤模型分组:适应性喂养7天后,采用随机数字表法将30只SD大鼠分为5组,分别为假手术组、模型组、舒脉胶囊低剂量组、舒脉胶囊中剂量组和舒脉胶囊高剂量,每组6只。

5.造模:假手术组大鼠沿左髂动脉走行逐层切开皮肤及组织并分离髂动脉和股动脉,其余各组均用球囊对大鼠髂动脉进行损伤以建立下肢动脉再狭窄模型。球囊损伤模型:术前无需禁食与禁水,用1%戊巴比妥钠(50ml/kg)进行麻醉,尾静脉用留置针注射肝素钠溶液(100U/100g),可根据实验进程需要补充注射肝素钠溶液;沿大鼠左髂动脉走行依次切开皮肤层、筋膜层和肌肉层,分离并充分暴露股动脉,用眼科剪给股动脉做V型切口,导丝穿过球囊做指引进入股动脉中,将球囊送至腹主动脉后,用肝素钠溶液作为扩充介质,给予6个大气压使得球囊扩张并且牵拉球囊至血管切口处,重复牵拉5次造成髂动脉内膜机械性损伤;撤出球囊及导丝,用8-0缝线缝合血管切口,5-0缝线逐层缝合肌肉、筋膜和皮肤,庆大霉素溶液冲洗手术区域,腹腔注射青霉素40000U预防感染。

6.给药:术后第1天,假手术组和模型组给予0.9%氯化钠溶液灌胃,每300g大鼠体质量给予1ml药液,1次/天。根据《药理实验方法学》将成人每日服用剂量与大鼠剂量进行换算,所得剂量为大鼠中等剂量,将其1/2中等剂量定为低剂量,2倍中等剂量定为高剂量[6, 8]。舒脉胶囊低剂量组给予0.0324g/ml舒脉胶囊0.9%氯化钠溶液灌胃,舒脉胶囊中剂量组给予0.0648g/ml舒脉胶囊0.9%氯化钠溶液灌胃,舒脉胶囊高剂量组给予0.1296g/ml舒脉胶囊0.9%氯化钠溶液灌胃。

7.取材:术后14天,1%戊巴比妥钠(50ml/kg)进行麻醉,打开大鼠腹腔进行腹主动脉采血,离心机4℃下1940×g,离心15min,离心结束后取血清分装冻存于-80℃冰箱。采血结束后,用0.9%氯化钠溶液冲洗3遍后用4%多聚甲醛冲洗血管腔,稳定血管形态并迅速取出左髂动脉,将血管均匀分成两份,其中一份血管放入4%多聚甲醛中进行固定,另一份放入液氮中保存后移至-80℃冰箱保存。

8.生存状况及行为学观察:实验期间观察各组大鼠生存状况、行为活动、伤口愈合、感染情况及体征,根据疾病临床表现以及Fontaine和Rutherford的分级和分类方法对大鼠术后状态进行评估。

9.血管组织形态学观察:标本石蜡包埋后进行弹力纤维染色,观察血管组织形态。根据弹力纤维染色结果计算内膜面积、中膜面积和内膜面积/中膜面积。

10.ELISA法检测血清IL-6水平:取大鼠血清,严格按照试剂盒说明书操作,检测IL-6,计算样本实际浓度。

11.免疫组化染色:观察血管壁IL-6和NF-κB水平。每张切片选择5个高倍视野(×400),分别计算血管内膜和中膜的IL-6和NF-κB p65的单位面积阳性平均光密度值。

12.蛋白免疫印迹:观察血管组织中NF-κB含量。提取血管组织蛋白,进行蛋白定量后,完成电泳、转膜、封闭及孵育抗体等操作,选取β-actin 作为内参,孵育一抗(NF-κB,1∶1 000;β -actin,1∶1 000)、二抗(HRP-Goat anti rabbit IgG,1∶10000),曝光后得到条带,用Image J软件进行分析灰度值。

13.统计学方法:应用SPSS 26.0与GraphPad Prism9.0进行统计学分析及做图,结果采用单因素方差分析,组间比较选用Tukey法检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.各组生存状况及行为学观察结果:30只大鼠手术结束后,无死亡,无跛行,无红肿,无渗出,创缘平整。术后第1天,30只大鼠进食量少;行动迟缓;术侧皮色:各组术侧下肢与各组健侧下肢比较皮色较白;术侧皮温:各组术侧下肢与各组健侧下肢比较皮色较凉。术后第2天,活跃程度:假手术组>模型组=舒脉胶囊低剂量组=舒脉胶囊中剂量组=舒脉胶囊高剂量组;垫料湿润度:假手术组>模型组=舒脉胶囊低剂量组=舒脉胶囊中剂量组=舒脉胶囊高剂量组;粪便色深浅:假手术组=模型组=舒脉胶囊低剂量组=舒脉胶囊中剂量组=舒脉胶囊高剂量组。术后第7天,各组活动如常;各组疮面完全愈合;活跃程度:假手术组>舒脉胶囊高剂量组>舒脉胶囊中剂量组>舒脉胶囊低剂量组=模型组;垫料湿润度:假手术组>舒脉胶囊高剂量组>舒脉胶囊中剂量组>舒脉胶囊低剂量组=模型组;粪便色深浅:舒脉胶囊高剂量组>舒脉胶囊中剂量组>舒脉胶囊低剂量组>模型组>假手术组;术侧皮色白:模型组>舒脉胶囊低剂量组>舒脉胶囊中剂量组>舒脉胶囊高剂量组,假手术组皮色正常;术侧皮温低:除假手术组外,其余各组术侧下肢与健侧下肢相比皮温较凉,模型组>舒脉胶囊低剂量组>舒脉胶囊中剂量组>舒脉胶囊高剂量组。术后14天,无跛行、坏疽及红肿出现;活跃程度:假手术组>舒脉胶囊高剂量组>舒脉胶囊中剂量组>舒脉胶囊低剂量组>模型组;垫料湿润度:假手术组>舒脉胶囊高剂量组>舒脉胶囊中剂量组>舒脉胶囊低剂量组>模型组;粪便色深浅:舒脉胶囊高剂量组>舒脉胶囊中剂量组>舒脉胶囊低剂量组>模型组=假手术组;术侧皮色白:模型组>舒脉胶囊低剂量组>舒脉胶囊中剂量组=舒脉胶囊高剂量组,假手术组皮色正常;术侧皮温低:假手术组双下肢皮温正常,模型组>舒脉胶囊低剂量组>舒脉胶囊中剂量组=舒脉胶囊高剂量组。术后14天内,30只大鼠无明显情绪变化,性情温顺。

2．血管形态学观察:弹力纤维染色结果可见假手术组内膜光滑,无增厚现象;与假手术组比较,模型组血管内膜明显增厚,管腔狭窄,舒脉胶囊低剂量组、舒脉胶囊中剂量组和舒脉胶囊高剂量组的血管内膜都有不同程度的增厚,详见图1。

图1 各组大鼠左髂动脉横断面切片图(弹力纤维染色)

术后第14天,与假手术组比较,模型组内膜面积明显增加,差异有统计学意义(P<0.0001),舒脉胶囊低剂量组内膜面积明显增加,差异有统计学意义(P<0.01),舒脉胶囊中、高剂量组内膜面积明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);模型组内膜面积/中膜面积明显增加,差异有统计学意义(P<0.0001),舒脉胶囊低剂量组内膜面积/中膜面积明显增加,差异有统计学意义(P<0.001)。术后第14天,与模型组比较,舒脉胶囊低、中和高剂量组内膜面积增加减少,差异有统计学意义 (P<0.05);舒脉胶囊低剂量组内膜面积/中膜面积明显减少,差异有统计学意义(P<0.05);舒脉胶囊中、高剂量组内膜面积/中膜面积减少,差异有统计学意义 (P<0.001),详见表1。

表1 各组弹力纤维染色内膜面积、中膜面积和内膜面积/中膜面积的比较

3.各组大鼠血清中IL-6水平比较:术后14天,与假手术组(20.22±4.75pg/ml)比较,模型组IL-6含量(692.56±130.28pg/ml)显著升高,差异有统计学意义 (P<0.0001),舒脉胶囊低剂量组IL-6含量(217.60±4.70pg/ml)升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,舒脉胶囊低剂量组、舒脉胶囊中剂量组(48.97±17.13pg/ml)和舒脉胶囊高剂量组(18.73±7.95pg/ml)IL-6含量降低,差异有统计学意义 (P<0.0001);与舒脉胶囊低剂量组比较,舒脉胶囊中、高剂量组IL-6含量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。

4.大鼠左髂动脉血管组织的免疫组织化学实验结果:术后14天,与假手术组比较,模型组IL-6含量显著升高,差异有统计学意义 (P<0.0001),舒脉胶囊低剂量组IL-6含量升高,差异有统计学意义 (P<0.01),舒脉胶囊中剂量组IL-6含量升高,差异有统计学意义 (P<0.05);与模型组比较,舒脉胶囊低剂、中和高剂量组IL-6含量降低,差异有统计学意义 (P<0.0001);与舒脉胶囊低剂量组比较,舒脉胶囊高剂量组IL-6含量降低,差异有统计学意义 (P<0.05)。术后14天,与假手术组比较,模型组NF-κB含量显著升高,差异有统计学意义 (P<0.0001),舒脉胶囊低剂量组IL-6含量升高,差异有统计学意义 (P<0.05);与模型组比较,舒脉胶囊低、中和高剂量组IL-6含量降低,差异有统计学意义(P<0.0001),详见图2。

图2 各组大鼠左髂动脉血管组织中的IL-6和NF-κB的免疫组织化学分析

5.大鼠左髂动脉血管组织中NF-κB蛋白表达比较:术后14天,与假手术组比较,模型组NF-κB蛋白含量显著升高,差异有统计学意义 (P<0.001),舒脉胶囊低剂量组NF-κB蛋白含量升高,差异有统计学意义 (P<0.05);与模型组比较,舒脉胶囊中剂量组和舒脉胶囊高剂量组NF-κB蛋白含量降低,差异有统计学意义 (P<0.05),舒脉胶囊高剂量组NF-κB蛋白含量降低,差异有统计学意义 (P<0.01),详见图3。

图3 各组大鼠左髂动脉血管组织中NF-κB比较

讨 论

血管腔内手术治疗能启动炎性反应,炎性反应是介入术后再狭窄形成的重要原因之一。球囊扩张或支架置入导致斑块破裂、内皮剥脱、中层撕裂,激活了循环中血小板和白细胞,从而激活了炎性反应。NF-κB是参与先天免疫和炎症的关键转录因子家族,也参与肿瘤的发生和发展[9, 10]。细胞因子是炎性细胞释放的主要信号分子,参与多种功能。促炎性细胞因子IL-6参与炎性分子的合成,与IL-6受体结合,导致NF-κB和JAKs-STAT途径的激活[11]。NF-κB 的活化导致 NF-κB抑制剂的磷酸化和降解,随后 NF-κB 的核易位和许多促炎趋化因子和细胞因子(如 IL-1、IL-6、IL-8和前列腺素E)的上调,进一步促进炎性反应[12]。NF-κB通路可加速细胞增殖,抑制细胞凋亡,促进细胞迁移和侵袭,诱导血管内膜增生,加速管腔再次狭窄[13,14]。

研究发现,舒脉胶囊能有效降低了血液中甘油三酯含量,增加下肢血液灌注量,建立侧支循环,明显改善肢体血流情况,抑制机体炎性反应的发生,降低再狭窄的风险,能有效缓解患肢寒凉、酸麻胀痛和间接性跛行等临床症状[15～17]。舒脉胶囊的诞生离不开名老中医房芝萱和王玉章在临床上的辛勤耕耘,它是中医智慧的结晶。舒脉胶囊由生黄芪、丹参、当归、鸡血藤、首乌藤、川芎、水蛭、桂枝、陈皮、山药和元参等组成,组方以黄芪为君,取其补气生血之效;当归配元参为臣药助力补益气血;鸡血藤、水蛭和首乌藤三药相配为佐药,疏通血脉。其组方之精妙是“补、生、通和活”四效皆有之,诸药合用发挥健脾益肾、活血通络之效,临床治疗下肢动脉硬化闭塞症、下肢动脉介入术后再狭窄和下肢静脉曲张都有着不错的疗效。

本研究发现,舒脉胶囊能有效减轻患者炎性反应,减低介入术后再狭窄发生的风险[17]。本研究结果显示,舒脉胶囊能有效改善球囊损伤大鼠的肢体血运状况,模型组的NF-κB p65表达与其余各组比较明显增加,NF-κB p65活化后表达明显增加。IL-6是NF-κB p65下游炎性细胞因子,在模型组的表达中也明显增加,二者存在一致性。NF-κB p65和IL-6在舒脉胶囊低、中和高剂量组的表达明显减少,各组间存在差异性。本研究结果显示,舒脉胶囊抑制介入术后再狭窄炎性反应,其机制可能与干预NF-κB p65通路的活化有关,但相关靶点和具体机制需要更深入的研究。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。