黏多糖贮积症Ⅱ型的基因诊疗

陈国庆 张惠文

上海交通大学医学院附属新华医院 上海市儿科医学研究所儿科内分泌遗传代谢病研究室（上海 200082）

1 黏多糖贮积症Ⅱ型概述

黏多糖贮积症Ⅱ型（mucopolysaccharidosis type Ⅱ，MPS Ⅱ）是MPS 中唯一一种X 连锁隐性遗传病。MPS Ⅱ发病率约为1.07/10 万，是我国和其他东亚地区最常见的MPS类型，约占所有MPS的一半。该病于1917年由Hunter医生首次描述，故又称为Hunter 病[1]。MPS Ⅱ是由编码艾杜糖‐2‐硫酸酯酶（iduronate 2‐sulfatase,IDS）的IDS基因变异所导致，该酶催化硫酸皮肤素（dermatansulphate，DS）和硫酸乙酰肝素（heparansulphate，HS）的2‐硫酸基团水解。艾杜糖‐2‐硫酸酯酶缺陷导致这两种糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAGs）无法正常水解，在组织中形成病理性堆积，累及多器官并影响生理功能，此为MPSⅡ发病的主要病理生理机制。

根据患者有无神经系统症状，MPS Ⅱ型主要分为两种类型，即有神经系统症状的严重型和无神经系统症状的轻型。共同临床症状和体征包括面容粗糙、骨骼畸形和关节僵硬、生长迟缓所致矮身材、呼吸道感染和呼吸困难、爪形手和心脏损伤等。听力减退是该病的特征性表现之一[2]。至少三分之二患者有腹股沟疝和脐疝、肝脾肿大[3‐5]。严重型患者发病早，有认知障碍和重度行为障碍，智力落后较为严重。症状进展较快，通常在生命第二个或第三个十年早期死于该疾病。轻型患者主要以皮肤，骨骼改变为主，一般不累及中枢神经系统，可活到40～50岁或更久。常见死亡原因是呼吸衰竭或心力衰竭[6]。

2 黏多糖贮积症Ⅱ型诊断与基因诊断

MPSⅡ的确诊需要结合临床症状、实验室检查，酶活性测定和基因检测进行综合诊断。出现MPSⅡ典型症状、新生儿筛查阳性或有家族史的疑似患儿需要进一步检测IDS活性和尿GAGs。IDS活性低于正常水平具有确诊意义。大多数患儿酶活性完全缺乏，部分轻型患儿酶活性为正常水平的0.2%～2.4%。对于尿GAGs 水平升高伴IDS 活性缺乏且其他溶酶体硫酸酯酶活性正常的患者，应进行基因检测以进一步诊断。

IDS基因位于染色体Xq 28，包含9 个外显子和8 个内含子，编码550 个氨基酸。IDS基因是MPS Ⅱ的唯一致病基因，但是IDS基因变异的异质性与MPSⅡ患者临床表现的异质性高度相关。截至2023年11月，已报告了1 223种不同的IDS基因变异，其中大片段或整个基因缺失、基因重排约占MPSⅡ型的19%～25%，小变异或微小病变（包括插入、缺失、重复等）约占MPS Ⅱ型的75%～80%。外显子9 的p.R468W/Q是我国热点变异，常导致重型MPSⅡ，而p.R443X和p.G374G突变常与MPSⅡ轻型相关[7]。

在距离IDS基因着丝粒远端约20kb的位置，存在一个假基因IDSP1，其外显子2、3和内含子2、3、7的碱基组成和IDS基因高度同源，可产生IDS-IDSP1重排。IDS-IDSP1重排不单是MPSⅡ的重要遗传学病因，也给IDS基因变异的诊断带来挑战。Sanger测序和多重连接依赖的探针扩增（MLPA）无法鉴别序列变异位于IDS基因或IDSP 1基因，必须采用等位基因特异性检测方法对基因组或者RNA 序列进行分析，才能得到可靠的诊断[8]。

MPS Ⅱ为X 连锁隐性遗传病，主要累及男性患者。但依然有罕见的女性病例被报道。女性MPS Ⅱ通常由非随机X染色体失活或X染色体异常重排所致[9‐12]，是引起女性MPSⅡ发生的主要原因[13]。

3 黏多糖贮积症Ⅱ型常规治疗

目前临床上针对MPS Ⅱ的主要治疗方法包括对症治疗、酶替代治疗（ERT）和造血干细胞移植（HSCT）。对症治疗主要包括：①神经系统，交通性脑积水和脊髓压迫可采用减压手术治疗。出现癫痫发作时用抗惊厥药物治疗。腕管综合征可行外科减压手术。脑积水可植入心室分流器。②骨骼系统，物理治疗和康复锻炼可以一定程度改善关节僵硬。关节严重畸形时可行关节置换术以改善功能。③呼吸系统，发生睡眠呼吸暂停可用简易呼吸器持续终末正压治疗，气道狭窄可行气管切开。④心血管系统，定期心电图、心脏超声检查。心脏瓣膜病引起相应反流或狭窄可行瓣膜置换术。⑤其他，定期检查眼底，及早发现视神经病变。反复中耳炎可行咽鼓管置换术[14‐15]。

ERT是轻型MPSⅡ的标准治疗方法。该疗法可显著降低患者肝脏和脾脏内GAGs 的贮积，临床可观察到肝脾体积明显减少，尿液中GAGs排泄减少。但静脉输注的酶在体内半衰期很短，需要两周一次定期静脉输注，反复输注酶有较低增加免疫反应产生的风险，影响疗效[16]。由于血脑屏障的存在，现有ERT 技术无法将替代酶输入大脑，不能改善关键的神经系统症状。尽管通过工程酶穿过血脑屏障[17‐18]和替代给药途径（鞘内或侧脑室内）[19]来改善组织靶向性的方法正在开发研究，现阶段尚无法在临床应用。此外，ERT价格昂贵。从可及性和治疗的便利性角度，ERT目前均有难以克服的困难。

与需要反复输注的ERT 不同，HSCT 可为患者持续提供酶,与ERT相比，移植的细胞可通过血脑屏障，早期行HSCT 可有效预防中枢和外周症状的出现，但由于临床诊断时间一般相对较晚，从发病到诊断的平均年限达3.5年，严重影响了HSCT的治疗效果[20‐21]。供体适配性也是一大难题，大部分移植后患者存在移植物抗宿主病（GVHD），需免疫抑制剂控制[22]。

4 基因治疗

基因治疗是指将正常外源基因通过一定方式导入靶细胞以纠正或补偿异常基因以达到治疗目的的手段。基因治疗可通过体内和体外途径实现。体内基因治疗需要将携带治疗基因的病毒载体引入患者体内，使用的病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒（AAV）载体，采用的基因组编辑技术主要为锌指核酸酶（ZFN）技术、转录激活效应因子核酸酶技术和CRISPR/Cas9技术三大类[23]。目前，只有ZFN和CRISPR/Cas9用于MPS的临床前研究，其中CRISPR/Cas9更多用于MPSⅡ的动物模型构建[24]。体外基因治疗包括在实验室培养患者细胞，将携带目的基因的病毒载体转导入细胞并回输入患者体内[25]。体外基因治疗主要使用逆转录病毒和慢病毒载体[26]。在大多数MPS中，将酶水平恢复到正常值的大约10%就足以抑制GAGs在器官中的堆积[27]。基因治疗主要优点是可提供长期、持续的疗效而无需连续给药。为了改善MPS 的神经症状，基因疗法也可以直接递送载体至中枢神经系统（CNS）[28]。

4.1 采用腺相关病毒（AAV）载体的基因治疗

4.1.1 临床前研究 目前，AAV 是基因治疗中应用最广泛的病毒载体之一。AAV是一种无包膜病毒，直径约25nm，属于细小病毒科。AAV包含一个相对较小的单链DNA基因组，约为4.7kb[29]。AAV载体可转导入全身各处细胞，在不分裂细胞中能提供长期的基因表达。AAV载体主要缺点为转导后病毒载体产生的免疫原性和载体包装容量小[30]。向小鼠、大鼠静脉注射AAV 9 后可穿过血脑屏障，靶向神经元和神经胶质细胞；颅内或鞘内注射时，AAV9能在多个脑区稳定表达。尽管AAV 9 穿透血脑屏障的特性尚未在灵长类动物上得到证实[31‐32]，但其仍被认为是最有可能改善CNS症状的AAV类型。

2006 年，Cardone 等[33]通过控制肝脏特异性启动子TBG，向2 月龄MPS Ⅱ小鼠尾静脉注射AAV2/8TBG‐IDS病毒载体。TBG启动子是由人甲状腺结合球蛋白（TBG）启动子和微球蛋白增强子组成的启动子，用于肝脏特异性外源基因转录表达。3～4月龄模型鼠与同龄野生型小鼠相比出现明显外观差异，包括颅骨短，脱发和脚趾增粗；在大脑不同区域（海马、丘脑、小脑和脑干）检测到细胞空泡化。在长达7 个月的时间里，治疗组小鼠的血浆和组织IDS活性均恢复到正常水平，大脑中IDS酶活性虽然比野生型小鼠低，但较模型鼠高约800倍。酶活性升高促使肝、脾、肺、肾、肌肉和大脑中堆积的GAGs被降解，尿液中GAGs水平正常化。2009年，该小组在出生第二天的IDS‐KO 新生小鼠中通过颞静脉注射携带人IDS cDNA的AAV 2/5 型载体，该载体通过巨细胞病毒启动子（AAV2/5CMV hIDS）转录翻译，并可在骨骼肌和肺等多种组织有效转导。该研究发现治疗后神经退行性变、星形胶质细胞增生和神经炎症得到了明显改善或完全纠正。在治疗组小鼠大脑中未检测AAV载体基因拷贝数，而在小鼠肝脏中检测到，表明中枢神经系统症状的改善是由于IDS酶穿过血脑屏障发挥作用[34]。

2016 年，Motas 等[35]研究小组向2 月龄小鼠脑池内注射了带有CAG启动子和IDS基因的AAV9载体。CAG启动子由巨细胞病毒增强子、鸡β‐肌动蛋白启动子和鸡β‐肌动蛋白内含子组成，用于驱动IDS基因在载体中的高效表达。在注射4个月后，治疗组小鼠大脑的IDS 酶活性显著增加，达到野生型小鼠大脑IDS酶活性的40%。大脑各区域（分为5个区域对应嗅球、尾壳核、丘脑后复合体、中脑、小脑）GAGs 下降至正常范围，神经胶质细胞胞质中的透明空泡明显减少，神经炎症消失。此外，载体还转导至肝脏，肺和心脏等器官，表现出与大脑类似的IDS酶活性和GAGs变化。治疗组小鼠行为缺陷被纠正，存活期显著延长。

2017 年Laoharawee 等[36]通过鞘内注射、尾静脉注射和脑室内注射将AAV 9 hIDS 注射入2 月龄MPS Ⅱ小鼠体内。对于脑室内注射治疗组，注射后28 周内血浆中保持超生理水平IDS 酶活性（比野生型高160倍）；在注射后10个月，小鼠心、肺、肝、脾、肾中仍保持较高的IDS 酶活性（肝脏中IDS 酶活性最高，约为野生型166倍）。相反，在大脑各功能区（海马、皮质、脑干、纹状体、嗅球、小脑）和脊髓中只有低水平的IDS 酶活性（野生型的7%～40%）。此外，IDS酶在CNS的持续表达对预防2月龄的MPSⅡ小鼠的神经认知缺陷有突出作用，然而鞘内注射、尾静脉注射处理的小鼠CNS中的IDS活性未出现明显升高。而后该小组在小鼠神经功能缺损出现后，侧脑室注射编码人IDUA 或IDS 的AAV 9 载体到5～6 月龄MPS I和MPSⅡ小鼠中。除了升高IDS酶活性和降低GAGs，小鼠认知功能得到部分恢复，表明基因转导可纠正已发生的神经功能障碍[37]。

4.1.2 临床研究 在上述临床前研究的基础上，REGENXBIO 公司在2018 年启动了通过脑室注射RGX‐121 治疗MPS Ⅱ神经系统症状的临床试验（NCT03566043）。RGX‐121是一种带有hIDS基因的重组AAV血清9型病毒载体。这是一项Ⅰ/Ⅱ期剂量递增研究，对象为4个月到5岁的儿童。截至2023年2月，已有15名受试者参加了3个不同剂量组（分别为1.3×1010、6.5×1010和2.0×1011基因组拷贝数/脑质量）[38]。受试者对RGX‐121耐受良好，无药物相关严重不良事件发生。在给药后约8周～两年时间内，受试者脑脊液中GAGs显示出一致的降低，下降幅度呈剂量依赖性，所有剂量组均在给药48周时接近正常范围；神经发育测试较入组时有明显提高[39]。试验后续会对试验者进行为期5年的随访和长期观察记录（NCT04597385）。另外还有对严重型MPSⅡ儿童（5～18 岁）的单剂量队列研究，受试者将接受单剂量（6.5×1010基因组拷贝数/脑重量）的RGX‐121，通过脑室内注射给药。在最初24周（研究初期）主要关注是否产生不良反应。在初期研究结束后，受试者将继续接受RGX‐121治疗后共计104周的安全性和疗效评估（NCT04571970）。

另一项临床试验旨在通过一种静脉输注携带hIDS的新型AAV‐HSC16载体（HMI‐203）评估安全性和疗效并和接受标准ERT治疗的患者疗效作比较（NCT 05238324）。AAV‐HSC 16 载体是从人CD 34+细胞中分离出的造血干细胞AAV变种。与其他血清型相比，这种载体在异体移植受体中能更稳定地表达[40]。患有MPS Ⅱ的成年男性将接受单剂量HMI‐203的静脉注射。计划分为3个不同剂量组，每组由3 名受试者组成。第一个剂量组每个受试者间隔60天给药，第二组和第三组的后续受试者间隔21天给药以审查安全性和有效性。该试验将持续5年，目前仍在招募志愿者[41]。

4.2 采用慢病毒载体的基因治疗

体外基因治疗通过收集患者体细胞并从中获得诱导多能干细胞（iPSC）[42]，使用慢病毒载体转导入iPSC 中，再自体移植回患者体内，提供稳定的基因表达并将缺失的基因传递给不分裂细胞，例如神经元[43]。Wakabayashi等[44]成功地将这种方法应用于MPSⅡ小鼠模型。他们向8～9周龄小鼠移植含有IDS基因慢病毒载体的造血干细胞。在小鼠接受移植后，大脑皮层，肝和心脏中观察到IDS酶活性增加和GAGs水平降低。此外，自噬相关底物（如p62）在大脑中下降到正常范围。与MPS Ⅱ小鼠相比，移植小鼠中没有出现神经元功能的恶化。

2022 年，Miles 等[45]设计了用慢病毒载体转导的造血干细胞，该载体携带由MNDU 3 启动子调控的人类IDS基因，MNDU3启动子由骨髓增生性肉瘤病毒长末端重复序列U3区域去除负调控区生成，驱动IDS基因转录表达。将造血干细胞通过尾静脉输注6～8周龄MPSⅡ雄性小鼠。治疗组小鼠颧弓变薄，血浆和组织（包括回肠、盲肠、结肠、脾、肺、肾、心、眼和脊髓）中出现超生理水平的IDS酶活性，足以使GAGs 处于正常值。在Barnes 迷宫和条件性恐惧实验中治疗组小鼠表现优于野生型小鼠。值得注意的是，治疗组小鼠大脑中的IDS 酶水平恢复到野生型小鼠的10%～20%，足以降解脑中堆积的糖胺聚糖并防止神经认知功能缺陷的出现。

4.3 基因组编辑技术

ZFN由DNA识别域和DNA剪切域两部分组成。DNA剪切域由核酸内切酶Fok I组成，当两个Fok I结合到一起时就能对DNA进行剪切。基于这个原理，锌指核酸酶成功实现了DNA 的定位和剪切，再结合外源导入的目的基因以及细胞自带的DNA 修复系统，便可实现基因编辑[46]。此前已有使用锌指核酸酶在白蛋白基因座靶向插入人凝血因子Ⅷ和因子Ⅸ，纠正血友病A，B 小鼠模型凝血功能障碍。白蛋白基因在肝细胞中的表达水平非常高，而且肝脏相对于其他组织进行基因导入和体内编辑的可操作性更强[47]。在此基础上，Laoharawee等[48]给6～9周龄的雄性MPSⅡ小鼠注射了3种递增剂量的AAV2/8载体（分别为2.5×1011，5×1011和1.5×1012基因组拷贝数/鼠），利用ZFN 在白蛋白基因座内含子1处靶向插入IDS基因。各剂量组MPSⅡ小鼠肝、脾、肾、肺、心和肌肉中IDS 酶活性升高和GAG 含量均明显降低，脑中GAGs没有明显的下降。其中，高剂量组MPS Ⅱ小鼠认知功能没有进一步恶化。基于临床前研究中表现出较好的疗效，第一项基于基因编辑的体内基因疗法的多中心Ⅰ/Ⅱ期临床试验在MPS Ⅱ患者中启动（NCT03041324）。该试验通过静脉输注给予受试者SB‐913（ZFN1、ZFN2、携带hIDS的AAV2/6），将IDS基因靶向置入受试者肝细胞基因组中，在高表达内源性白蛋白基因座的控制下发挥作用。试验包括三组不同剂量（分别为5×1012，1×1013和5×1013vg/kg），共招募9名志愿者[49]。在治疗后16 周，中剂量组受试者的尿中HS 和DS 较基线有所下降（尿GAG下降51%，硫酸皮肤素下降32%，硫酸类肝素下降61%）；然而，未检测到血浆IDS 活性的升高[50]。截至治疗后36 周，受试者较入组前血浆中没有显著IDS 酶升高和uGAG 的下降。目前，这项试验已于2022年10月终止，在为期10年的长期随访研究（ST‐IVPRP‐LT01，NCT04628871）中继续监测该药的安全性。

CRISPR/Cas 9 技术目前尚未在MPS Ⅱ模型上进行相关报道，2018 年Schuh 在MPS I 模型小鼠采用携带CRISPR/Cas9质粒和阳离子脂质体进行基因治疗，血清中出现持续6个月的α‐L‐艾杜糖醛酸酶活性增加，肺和心脏中GAGs减少[51]。

5 总结

基于ERT和HSCT的MPSⅡ特异性治疗能够显著改善预后，但两者都有一定局限。基因治疗作为一种崭新的疗法，能够长期提供缺陷酶的表达，通过交叉校正机制，经过基因修饰后的细胞能够产生和释放溶酶体酶，被其他细胞和器官吸收[52]。体外基因疗法大多采用慢病毒载体，但目前仍然在临床前研究阶段，还需要进一步分析体外疗法的疗效和安全性。体内基因疗法在取得一定进展的同时，也依然存在递送和表达等问题。颅内注射给药会导致大脑组织损伤以及有限的载体分布和不均匀的空间覆盖，系统性AAV递送（静脉注射）又难以特异性靶向特定细胞类型。此外，人体内可能会存在传统AAV的中和抗体或不能充分跨越生物屏障（如血脑屏障）。同时也要考虑到治疗确诊时间较晚的患者无法逆转已经造成的损伤。早期诊断并发现症状前MPS患者，可能是未来提升基因治疗效率中与技术开发同样重要的环节[53]。