糖尿病性视网膜病变的发病机制:miRNAs研究进展△

刘 彤 吴松笛

糖尿病性视网膜病变(DR),是糖尿病的主要微血管并发症,预计到2045年,全世界DR患者将达到1.6亿,其中4 480万患者视力将受到影响。由于DR早期症状不明显,易被患者忽略造成不可逆的视力损伤[1]。因此了解DR的发生发展机制,寻找诊断生物标志物尤为重要。微小RNAs(miRNAs)是一类内源性小分子非编码RNA,具有序列保守性、表达时序性及疾病特异性等特点[2-3]。此外,miRNAs因其在血浆、血清、脑脊液及代谢产物中的可检测性和稳定性,已成为疾病发生发展的重要生物标志物[4]。我国已有miRNAs相关检测试剂盒获批上市。miRNAs作为调节因子,靶向参与了DR的炎症反应、氧化应激、细胞死亡及血管新生等病理性过程,并在其中起重要的调控作用[5-6]。现就miRNAs在DR中发挥的调控作用进行综述,为DR的诊断、预后判断及治疗提供参考依据。

1 miRNAs及其作用机制

miRNA是由20～24个核苷酸组成的一类内源性小分子非编码RNA[2,7]。miRNA经RNA聚合酶II转录为含有一个茎环结构的初始miRNA(pri-miRNA),后者经细胞核内的微处理复合物剪切形成前体miRNA(pre-miRNA),并被转运至细胞质中,经识别、剪切及修饰后形成miRNA二聚体,随后一条链被降解,另一条链形成成熟的miRNA[8-9]。成熟的miRNA形成的诱导沉默复合物与靶位点3’UTRs序列结合发挥调控基因表达的作用[7]。

2 DR简介

《我国糖尿病视网膜病变临床诊疗指南(2022年)》中指出,DR是一种慢性进行性致盲性眼病,是因长期高血糖导致的视网膜微血管损害,并同时合并视网膜神经胶质网络病变的糖尿病视网膜并发症[10]。临床上DR被分为2个阶段,即以血管透性增强、毛细血管闭塞为主要特征的非增生型DR(NPDR)和以视网膜血管新生为特征的增生型DR(PDR)[11]。长期高血糖引发的视网膜炎症、血管生成、氧化应激及细胞死亡等病理性过程与DR发展的潜在作用机制有关[5]。

3 miRNAs与DR相关研究

3.1 miRNAs与氧化应激

正常代谢过程中,机体通过抗氧化酶和非酶抗氧化剂调控抗氧化系统的防御机制以维持氧化还原稳态,当活性氧(ROS)的产生超出系统防御能力范围时,稳态被打破引发氧化应激[12]。糖尿病患者视网膜处于高糖环境,多元醇途径、己糖胺途径、蛋白激酶C(PKC)途径及晚期糖基化终产物积累等代谢异常途径可直接或间接产生过量的ROS,引发或加重细胞的氧化应激,进而使线粒体功能紊乱,视网膜组织功能受损,加剧DR发展[13-14]。

miRNAs可通过介导与氧化应激有关的酶、转录因子及相关通路等方式来调控DR中的氧化应激水平[5]。Chen等[15]通过转染的方式在高糖诱导的视网膜色素上皮(RPE)细胞内表达miR-455-5p,检测到细胞中ROS、丙二醛及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)含量减少,超氧化物歧化酶、过氧化氢酶及谷胱甘肽过氧化物酶的含量增加,从而减轻细胞氧化损伤,该过程是通过miR-455-5p介导抗氧化酶活性调控氧化应激水平来实现的。在DR大鼠Müller细胞中,miR-365主要定位于内核层,当氧化应激加重时,miR-365含量增加,细胞胶质化程度加剧,该过程与miR-365负调控靶基因基质金属蛋白酶抑制剂3(TIMP3)有关,而TIMP3的表达可减轻氧化应激,当抑制Müller细胞中的miR-365表达时,细胞胶质化程度减轻,氧化应激减弱[16]。核因子E2相关因子2是抗氧化应激调控的关键转录因子,也是miR-489-3p的靶基因,lncRNATPTEP1的过表达可通过miR-489-3p/核因子E2相关因子2轴减轻细胞氧化应激和抑制细胞增殖,从而对DR的发展起到抑制作用[17]。Yu等[18]发现,在DR相关人视网膜微血管内皮细胞(hRMECs)模型中,circ-UBAP2高表达,其作为miR-589-5p的“分子海绵”间接促进了早期生长反应蛋白1的表达,而后者可促进细胞氧化应激及细胞功能性障碍;当敲低circ-UBAP2表达时,miR-589-5p竞争性抑制作用部分解除,早期生长反应蛋白1表达受阻,细胞的氧化应激和细胞功能性障碍得到缓解。Tu等[19]研究发现,利用褪黑素介导母系表达基因3/miR-204/沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)轴可促进叉头框蛋白O1的去乙酰化作用,进而减轻DR模型中Müller细胞的氧化应激水平。在DR细胞及动物模型中,miRNAs可通过调控高糖引起的代谢异常途径中的关键酶、中间产物及转录因子的表达来缓解氧化应激水平。

3.2 miRNAs与炎症反应

DR属于慢性低度炎症。长期高血糖刺激所引发的炎症反应造成视网膜缺血缺氧,促进DR发生发展。炎症反应与炎症相关因子、炎症信号通路及炎症细胞的调控有关[20]。

miRNAs可通过介导炎症相关分子或炎症细胞的形式来调控DR模型中的炎症水平[6]。miR-455-5p在高糖诱导的RPE细胞(ARPE-19)中通过靶向调控细胞因子信号抑制因子-3来降低细胞中IL-1β、IL-6及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量,从而发挥抗炎作用[15]。高糖诱导的ARPE-19中,miR-19b高表达,可促进IL-1β、IL-6及TNF-α的表达,该过程是通过miR-19b与靶基因SIRT1结合,抑制后者表达来实现的,而过表达的lncRNAH19可竞争性结合miR-19b,从而减轻细胞的炎症反应[21]。miR-30c-5p可调控PLCG1的表达,后者表达上调可阻断PKC/核转录因子-κB(NF-κB)通路。He等[22]通过脐带间充质干细胞(hUCMSCs)-外囊泡(EVs)转运miR-30c-5p方式减轻了DR模型中人视网膜内皮细胞(hRECs)的炎症反应。具有抗氧化作用的褪黑素还可通过母系表达基因3/miR-204/SIRT1轴介导NF-κB p65亚基的去乙酰化,从而降低DR模型中Müller细胞的炎症反应[19]。在DR大鼠模型中,miR-124可通过下调转录因子PU.1及脂筏蛋白Flot1的表达来抑制小神经胶质细胞过度激活,从而减少IL-1β、TNF-α、Cd74、C-C基序趋化因子配体2、C-C基序趋化因子配体3及血管细胞黏附分子1等因子的产生,减轻炎症反应,改善神经视网膜功能[23]。miRNAs可通过直接或间接降低炎性因子的表达或阻断NF-κB等炎症相关通路来减轻炎症反应。

3.3 miRNAs与血管新生

血管生成因子和抗血管生成因子之间平衡的打破是NPDR发展成PDR的关键,其中主要的血管生成因子有血管内皮生长因子(VEGF),其可介导缺血诱导的视网膜新生血管形成[5]。

研究发现,与NPDR患者相比,PDR患者血清中miR-15b的含量更低、VEGF含量更高,而在DR的hRMECs模型中,miR-15b增加可抑制血管新生,其机制是通过miR-15b负调控下游靶基因VEGF表达来实现的[24]。Xiao等[11]研究发现,敲低miR-423-5p表达可抑制高糖诱导的hRECs及hRMECs中血管新生,该过程是通过miR-423-5p负调控下游靶基因同源结构域相互作用蛋白激酶2的表达实现的,而后者可介导与视网膜血管生成密切相关的缺氧诱导因子-1α/VEGF信号通路。Wang等[25]发现,PDR小鼠视网膜组织中miR-30b表达上调,而在高糖诱导的RMECs模型中,敲低miR-30b表达可通过上调SIRT1的表达来减少VEGF的表达并抑制血管新生。通过检测DR的ARPE-19细胞模型中凋亡标志物Bcl-2、Bax及Caspase-3,Chen等[15]发现,miR-455-5p还可通过靶向细胞因子信号抑制因子-3对血管新生起抑制作用。miRNAs可通过直接或间接介导VEGF的表达来调控血管新生。

3.4 miRNAs与细胞凋亡

DR发展过程中,如不及时干预血-视网膜屏障损伤会导致患者视力丧失,而血-视网膜屏障损伤与炎症反应引发的周细胞、内皮细胞及RPE细胞凋亡关系密切[26]。

去乙酰化酶SIRT1参与了细胞凋亡调控过程,在DR大鼠模型中,沉默miR-34a表达可通过介导下游靶基因SIRT1的表达起到促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的作用[27]。DR大鼠及ARPE-19细胞模型中,miR-200a-3p表达下调,当增加miR-200a-3p表达量时,细胞的凋亡程度和炎症反应得到缓解,其机制是过表达的miR-200a-3p可通过负调控下游靶基因转化生长因子-β2(TGF-β2)对TGF-β2/Smad通路起到阻断作用[28]。同样是DR的ARPE-19细胞模型,miR-320b可通过介导Timp3的表达来调控高糖诱导的细胞凋亡及炎症反应,添加miR-320b抑制剂或过表达Circ_NNT,TIMP3水平升高,细胞凋亡及炎症反应减轻[29]。在DR大鼠及hRMECs中注入hUCMSCs-EVs后,炎性反应及细胞凋亡受到抑制,Xu等[30]对hUCMSCs-EVs中的miRNAs进行了差异性分析,发现69个miRNAs表达存在差异性,经验证,miR-18b表达差异显著,研究显示,miR-18b可通过负调控丝裂原激活蛋白激酶激酶激酶1表达抑制NF-κB p65的磷酸化,发挥抗炎及抗凋亡作用,从而缓解DR的发展。miRNAs可通过调控SIRT1、TGF-β2及TIMP3等基因的表达抑制细胞凋亡。

3.5 miRNAs与细胞焦亡

炎性细胞坏死,又称细胞焦亡,是一种新型细胞程序性死亡,其与炎症小体及Caspase-1的激活有关[31]。研究显示,DR模型中内皮细胞、周细胞、Müller细胞、小胶质细胞及RPE细胞等多种视网膜细胞均可发生焦亡[6]。

Gu等[32]发现,miR-192可通过负调控下游靶基因FTO的表达来抑制高糖引起的RPE细胞焦亡,其中FTO的表达与NLRP3的甲基化修饰有关。DR的RPE细胞模型中,下调miR-590-3p表达可促进细胞焦亡,该过程中miR-590-3p可负调控下游靶基因NOX4及NLRP1,作者推断NOX4对细胞焦亡的调控可能与ROS/硫氧还蛋白相互作用蛋白/NLRP3轴有关,具体调控机制还需进一步研究[31]。Xi等[33]在细胞焦亡相关机制研究过程中发现,DR细胞模型中ROS的产生可促进细胞焦亡,而过表达miR-130a可通过TNF-α/超氧化物歧化酶1/ROS轴来缓解细胞焦亡。在DR细胞模型中发现,lncRNA MIAT与GSDMD-N表达均增加,而GSDMD-N的表达对细胞焦亡有促进作用,当敲低lncRNA MIAT表达水平时,可部分解除对miR-342-3p的竞争性抑制作用,而后者可通过负调控Caspase-1的表达来缓解细胞焦亡[34]。miRNAs可通过介导凋亡小体及Caspase-1表达来调控细胞焦亡。

3.6 miRNAs与铁死亡

铁死亡是一种铁依赖性的多不饱和脂肪酸过氧化所导致的新型细胞程序性死亡。研究显示,铁死亡在糖尿病及DR的发展中起重要作用[6]。

溶质载体家族1成员5主要参与L-谷氨酰胺的转运和代谢过程,高糖诱导的RPE细胞中,miR-338-3p表达上调,其可通过负调控溶质载体家族1成员5表达来介导细胞铁死亡,从而加剧DR发展[35]。DR的ARPE-19细胞模型中,表达上调的circ-PSEN1可通过miR-200b-3p/CFL2轴促进细胞铁死亡[36]。分子酰基辅酶A合成酶长链家族成员4是铁死亡调控因子之一,也是miR-7-5p的下游靶基因,lncRNA ZFAS1可通过ZFAS1/miR-7-5p/分子酰基辅酶A合成酶长链家族成员4轴激活高糖诱导的hRECs铁死亡[37]。DR发展中,miRNAs可通过介导与细胞铁死亡有关的调控因子发挥作用。

4 结束语

在DR的发生发展过程中,miRNAs作为调控因子,可通过调控氧化应激、炎症反应、血管新生及细胞死亡等病理过程中的关键酶、转录因子、产物或相关通路来发挥重要作用。其中,circRNAs和lncRNAs作为miRNAs的分子海绵介导下游靶基因的表达以及外泌体转运miRNAs的相关研究已成为研究热点。除上述细胞死亡方式外,DR中泛凋亡的研究也引起了学者的重视,但有关miRNAs在其中的调控作用还未见报道[38]。通过对miRNAs调控作用的研究,不仅为DR相关病理过程的机制研究提供思路,还可为辅助诊断和预后判断生物标志物的寻找提供更多可能。然而,现有研究也面临着一些困难,如miRNAs调控靶基因的复杂性、临床样本量较小的局限性、提取检测以及验证方法的差异性及建模的不一致性等[39-40]。因此,有关miRNAs簇的调控研究、多中心临床合作、提取检测方法标准化及新模型的构建将被予以重视。未来,随着表观遗传学和生物医学工程的发展,miRNAs在DR领域的研究或将上升至细胞间串扰及基因靶向治疗。