影响实验动物视网膜电图结果稳定性的因素及对策

金昱，梁丽娜，李佳贤，周维，许凯

如今，中医眼科学的研究不再局限于以经典校注、病证结合、辨证论治和临床观察为主的传统模式，也发展出了运用设计良好的基础实验与临床循证研究相结合的现代科研体系。中医证候动物模型在中医基础实验中已经有了很大发展，而动物光学相干断层扫描（optical coherence tomography，OCT）、眼底彩照等活体指标的应用让中医眼科学的基础研究又向前迈进一步，其中，视觉电生理检查是对眼功能活体指标的丰富。临床常用的视觉电生理检查项目包括视觉诱发电位（visual evoked potential，VEP）、视网膜电图（electroretinogram，ERG）、多焦视网膜电图（multifocal electroretinogram，mf ERG）和眼电图（electro-oculography，EOG），ERG 又可分为闪光ERG 和图形ERG。ERG 可用于研究各种视网膜疾病及其潜在机制，如视网膜色素变性、慢性高眼压[1]、视神经病变[2-3]、青光眼[4]等，也可作为评判药物及干预措施疗效的重要指标、用于研究视网膜的基本生理学。可进行ERG 实验的物种多样，包括啮齿动物[5]、猫、狗、家兔[6]和非人类灵长类动物等。但该活体结果的采集在操作中具有较大难度，电极、麻醉状态、刺激强度和持续时间等检测条件的变化，使得ERG 产生的波形会出现基线不稳、杂波较多等情况，影响数据的准确性，对后续数据分析造成困扰，故检测时常建议双眼对照检查，如何提高ERG 结果的稳定性这一问题亟待解决。基于此，本文对眼科动物实验中影响ERG结果稳定性的因素进行综述，并论述相应的解决方案，现报道如下。

1 影响ERG稳定性的因素及解决方案

1.1 电极

劣质电极会产生不稳定或有噪声的波形[7]。YIP YWY等[8]将带有放大器的定制活性电极与标准惰性ERG 电极记录下的电图质量进行对比，对动物注射氯胺酮、甲苯噻嗪和乙酰托马嗪麻醉，在所有超阈值刺激强度下，活性电极的暗适应a波、b波振幅较高，但仅在-3.25～-1.00 log cd.s.m-2范围内差异有统计学意义；明适应也有相同趋势，在-0.75～0.48 log cd.s.m-2范围内差异有统计学意义。与惰性电极相比，活性电极的变异系数（coefficient of variation，CV）和重复系数（coefficient of repeatability，CR）较低，a 波、b 波参数的组内相关系数（intra-class correlation coefficient，ICC）较高，噪声显著降低，可在较低的刺激强度下记录信号，即活性电极的重复性、重现性和可靠性均较好。

BAYER AU 等[9]使用成年C57 BL/6小鼠和Wistar大鼠进行ERG 检测（Ganzfeld 或频闪光刺激的暗适应及明适应），对便捷程度、角膜上皮损伤程度、参数的幅度、再现性、双眼准确性和可靠性等方面进行评价。电极选用单极金丝隐形透镜电极（contact lens electrode，CLE）、棉芯银-氯化银电极（cotton-wick silver-silver chloride electrode，CSCE）、DTL 纤维电极（DTL fiber electrode，DTLE）和圆形不锈钢丝电极（stainless steel wire electrode，SSE），并观察安装电极的难易程度，使用荧光素眼底血管造影（fundus fluorescein angiography，FFA）评估ERG 记录后动物角膜的磨损情况。结果显示，CLE 电极具有较大的暗视振幅和振荡电位，并且在分析测试-再测试数据时，显示出最佳的一致性。然而，安装CLE 电极所需时间最长。使用SSE 电极会导致小鼠角膜磨损最严重，而CLE 电极则几乎不会造成大鼠角膜损伤，并且允许长时间操作。因此，使用CLE电极可以获得较大的振幅和更高的再现性，但正确放置电极在角膜上的位置非常重要。国际临床视觉电生理学会（international society for clinical electrophysiology of vision，ISCEV）编写的《ISCEV 全视野临床视网膜电图标准（2015年）》[10]建议电极的位置与角膜或附近的球结膜接触。研究[11]显示，振幅随电极距离角膜顶点的距离增大而减小。1 项临床试验[12]招募了13 名年龄在13～64 岁之间的正常对照受试者（视力均为1.0），当DTLE放置在结膜囊深处时，闪烁光反应降低约20%～25%；在角膜上时，差异范围为8%～27%；在结膜穹窿中时，差异范围为10%～25%。故研究者认为，应确保在多次记录中将电极放置在相同位置，记录期间尽量保持其稳定且不移动，而电极本身放置位置对ERG的诊断准确性影响较小。

解决方案参考如下，（1）选择高质量的电极：使用定制的活性ERG 电极，其噪声较少，可以记录较低刺激强度下的反应，产生更大的信号幅度且具有可重复性。目前，美国Diagnosys 公司的ESPION 型视觉电生理检测系统已应用于临床[13-14]，可以进行多种检测，包括VEP、mfERG。其动物实验中[15]可以根据不同的实验需求使用不同的电极，碗状电极能够紧贴角膜表面，而且无需接地线，简化了实验操作流程。（2）合理放置电极：在记录过程中，要确保电极每次的位置固定并紧密贴合角膜，避免空泡，减少噪声和不稳定性。同时，要注意保护角膜，可以使用玻璃酸钠滴眼液、羧甲基纤维素钠滴眼，以减轻电极对角膜损伤并降低干扰。

1.2 介质的应用

在大鼠ERG 记录中，常使用玻璃酸钠滴眼液或0.9%氯化钠溶液等导电液介质来提高导电性，减少金属电极对角膜上皮的损伤。然而，在实际操作中，过量使用玻璃酸钠滴眼液可能会影响电信号。戴旭锋等[16]将大鼠分为干燥组、适量组和过量组，适量组滴加了少量玻璃酸钠滴眼液，但保持角膜基本干燥；过量组滴加了大量玻璃酸钠滴眼液，使整个结膜囊充满。实验设置暗适应ERG 的刺激强度为3.0 cd·s·m-2，单次闪光刺激持续时间5 ms，刺激之间间隔1 min，通频带设置为1～100 Hz，观察了b 波峰时和幅值。结果显示，干燥组的电图基线不稳定，适量组和过量组的基线相对稳定，但过量组中有2 只大鼠出现波形阻滞情况。b 波峰时3 组之间的差异无统计学意义。在幅值方面，干燥组和适量组没有明显差异，但过量组的波幅较另外2 组降低，差异有统计学意义。

解决方案参考如下，玻璃酸钠滴眼液的使用确实可以降低干扰，但过量使用会影响ERG 振幅大小。因此，在ERG 检测过程中，导电液的使用量以保持球结膜和睑结膜微微湿润为宜。

1.3 电噪声与次声

来自环境或其他设备的电噪声会干扰电生理检测，导致波形不稳定或有噪声，如邱萍等[17]给予实验组大鼠8 Hz、130 dB 的SPL 的次声暴露，并在各个时间点进行电生理检测，次声压力舱舱内各空间点次声的频率和声压级水平保持一致，该电激励式次声压力舱系统为研究者自主研制。对照组每日置于次声舱中不接受次声暴露。结果显示，在次声暴露1 d后电生理改变以a波为主，而在4 d、7 d的电生理检查中，b 波的下降反超a 波，暴露时间进一步延长，振荡电位（oscillatory potentials ，OPs）波的振幅异常成为主要变化，说明次声在不同的暴露阶段对视网膜各层的影响不一。

解决方案参考如下，通过使用高质量的电缆并正确连接设备，将电噪声降至最低。检测时应无电噪声源，如荧光灯等。

1.4 麻醉药物

麻醉是许多动物实验的必要过程，针对不同的实验操作可以选择不同的麻醉方式。846 合剂又称速眠新注射液，是盐酸二氢埃托啡和氟哌啶醇、赛拉唑、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的复方制剂，有镇静、催眠、肌松、镇痛等综合作用。侯豹可等[18]对比观察了4 种麻醉药物（速眠新846、乌拉坦、戊巴比妥、氯胺酮）对大鼠视觉电生理的影响，药物均能达到全麻的效果，诱发出ERG 和VEP 的波形，但麻醉效果和波形存在差异。速眠新组进入全麻状态时间短，肌肉松弛作用好，麻醉持续时间较长，操作过程中状态较稳定，大鼠麻醉后眼球突出明显，有利于放置角膜电极。乌拉坦、戊巴比妥麻醉起效时间长，肌肉松弛作用一般。乌拉坦麻醉后，大鼠眼睑不能完全张开，眼球不突出，放置角膜电极时可能存在困难。同时，该药对生理状态的影响较大，实验后2～3 d 大鼠仍处于频繁昏睡状态。使用氯胺酮麻醉效果不佳，肌肉松弛作用差，麻醉持续时间不长，长时间检查时需补药。对于电生理数据（暗适应ERG 光强为3.5 cd·s·m-2），乌拉坦的b 波潜伏期最长，氯胺酮最短；速眠新组OPs O2波幅值最高，戊巴比妥组最低；明适应ERG 和20 Hz 闪烁反应氯胺酮组b 波幅值最高，闪光视觉诱发电位乌拉坦组大鼠P100潜伏期普遍较长，氯胺酮组大鼠普遍较短。在小鼠实验中[19]，当注射2.5 mg/kg 或5.0 mg/kg氟哌啶醇时，ERG 没有显著变化，注射量超过20 mg/kg 时b 波的振幅会显著降低。与该结果类似的是，GJÖRLOFF K等[20]采用分级剂量的芬太尼（0.05～4.00 mL/kg）对家兔进行麻醉，推荐诱导全身麻醉的剂量为0.50～1.00 mL/kg，1.00 mL/kg接近致死剂量。另有研究者探究氯胺酮与乌拉坦对家兔视觉电生理的影响[21]，二者在暗适应OPs 波的比较中未见明显差异，但氯胺酮暗适应b 波潜伏期和a 波幅值较低，O2幅值、明适应b波幅值和30 Hz闪烁反应P2幅值均较高。

解决方案参考如下，麻醉状态不佳会影响动物的自主呼吸节律，肌肉无法放松，对电生理波形稳定性非常不利。麻醉方案应针对动物物种及个体进行优化，在整个记录过程中监测麻醉深度。文献[18]报道称采用速眠新846 全麻状态时间短，肌松作用好，麻醉持续时间较长，大鼠麻醉后眼球突出明显，有利于加装角膜电极，在进行电生理检查的过程中较稳定。动物麻醉加入肌肉松弛剂、镇静剂的复合麻醉剂利于实验者操作及检验过程的平稳进行。

1.5 刺激光频率和光强度

在蛙眼及人眼中，去除视杆系统对视锥系统的抑制，明适应闪光ERG 的幅值增高[22]。有研究[23]将大鼠明适应10 min 后（背景光强37.00 cd·s·m-2），记录不同刺激频率和不同刺激光强下的ERG 数据，发现低频（≤10 Hz）时视杆系统的活动会夹杂在电生理反应中，随频率的升高而减少；但频率≥25 Hz 时，波形不再稳定且幅值较低。改变刺激光强度，波幅会有规律性改变，在低于3.5 cd·s·m-2时，呈正相关。因此，该研究者认为在明适应闪烁ERG 检查中，应用15～20 Hz 光频率、3.5 cd·s·m-2的刺激光强度分离出的视锥系统功能较好。该研究团队[24]通过改变不同通频带和不同光强刺激，探讨小鼠ERG 的OPs 检查最适合的通频带及闪光强度，先在不同通频带下记录OPs，找出小鼠最适宜指标，在此基础上，改变光强度，再次记录OPs。结果显示，在通频带75～300 Hz时，OPs幅值和潜伏期最为稳定；OPs幅值与光照强度呈正相关，而O2波的潜伏期呈缩短趋势，在2.0 cd·s·m-2（标闪）光强条件下相对稳定。

解决方案参考如下，根据实验室具体环境确定波形最稳定的光频率及光强度，可参考文献[23]中数据：大鼠应用15～20 Hz 频率、3.5 cd·s·m-2强度的刺激光；小鼠视觉电生理检查时[24]，其振荡电位的闪光强度应为2.0 cd·s·m-2（标闪），通频带应为75～300 Hz。

1.6 眼球运动伪影

动物的眼球运动会导致电极移动，影响波形稳定。猜测是由于眼球运动影响角膜电极与角膜贴合紧密度，二者间产生空隙，导致信号传导出现波动。

解决方案参考如下，为了最大限度地减少眼球运动造成的影响，检测过程中稳定动物的头部和眼睛至关重要，可以使用定制的头部固定器或咬杆来达到固定目的。

1.7 信号放大不足

该因素属于系统参数设置问题，如果信号放大不足，则记录的波形可能过于微弱或嘈杂，无法进行分析。

解决方案参考如下，可以通过调整设备上的参数来优化放大信号，可能需要增加信号处理软件中的放大倍数。实验室应根据各自实验环境调整具体参数，建立自身的最适宜、最稳定的参数指标。

1.8 时间节律

由于啮齿类动物存在特殊的时间节律，有研究[25]选取昆明小鼠、BABL/C 小鼠和C57BL/6J小鼠，测量小鼠在6个时间区间（4:00～8:00、8:00～12:00、12:00～16:00、16:00～20:00、20:00～24:00、24:00～4:00）的ERG 数据，按照《ISCEV 全视野临床视网膜电图标准（2022 年）》[26]中的方案，记录暗适应ERG、最大混合反应、明适应的数据。结果显示，小鼠在夜间活动频繁，进入麻醉状态的时间明显延长；ERG 也表现出较为规律的节律性，其中b 波幅值在20:00～24:00 达到最高，4:00～8:00 开始下降，在12:00～16:00 幅值最低。但明适应b 波和暗适应b波节律性相反。这可能与小鼠这一物种的活动规律有关，可见时间节律能影响小鼠视觉电生理检查的稳定性。

解决方案参考如下，为了便于实验的可重复性和各实验结果之间的对比，小鼠电生理检查时应考虑时间节律对视觉电生理的影响，在实验设计时应尽量保证在同一时间段检测ERG。

1.9 患视网膜疾病的动物

视网膜变性动物的视网膜细胞可能无法产生稳定的电信号，从而导致波形不稳定[27]。

解决方案参考如下，在患有视网膜疾病的动物模型[28]中，可能需要使用不同的记录技术或调整记录参数以获得可靠的记录。

2 小结

为提高数据的可靠性，在动物ERG 检测的过程中，首先应确保周围环境安静，减少环境噪声及电噪声；麻醉药物应在安全的同时保证实验动物肌肉松弛，呼吸有节律，麻醉时间保证能够完成ERG 检测全过程。其次，连接设备时应确保电极与动物角膜紧密贴合，并尽量保证每次电极放置位置相同，导电液以角膜结膜湿润为宜。在进行实验前，根据实验动物种类不同及具体实验室环境，摸索最适宜的通频带、光照频率及强度，分析相关的软件参数，最大可能保证在同一时间段对实验动物进行ERG 检测。通过以上措施，可以提高动物视网膜电生理结果的质量和可靠性。此外，仔细分析和解释记录也显得尤为重要。应结合具体实验的评价指标，采用合理的分析方法得出结论。未来在中医眼科学的基础实验中，研究者们要充分利用OCT、FFA、ERG 等活体指标来检测视网膜功能，完善实验操作步骤获取最稳定可靠的结果，丰富基础理论研究，推动中医眼科学的进一步发展。