椎间盘退变中外泌体的功能、作用机制和临床治疗

苗鸿雁 冯晶 刘伟 杜世阳 杨若鹏 尹志源 肖子钧 徐磊

下腰痛是一种常见的症状，多由软组织损伤、骨质疏松、肿瘤、感染、骨折和非特异性疼痛等引起，而临床上 40%～50% 的下腰痛是由腰椎间盘退变 ( intervertebral disc degeneration，IVDD ) 引起的[1]。导致 IVDD 的确切病因尚不清楚，但随着机械负荷、衰老、肥胖、慢性应激等危险因素的增加，IVDD 的患病率呈逐年上升趋势[2]。临床治疗 IVDD 的方法主要分为保守治疗和手术治疗。保守治疗包括卧床休息、药物治疗、牵引、针灸推拿等物理疗法[3]，这些方法在缓解症状方面有着一定的作用，但不能逆转 IVDD[4]。手术治疗旨在切除退变的椎间盘、消除根性疼痛，但由于脊柱生物力学的改变，常伴有明显的后遗症或邻近椎间盘的再突出。基于以上背景，阻止或逆转IVDD 并恢复其原有的结构与功能成为亟需解决的问题。近年来，生物活性分子注射、细胞治疗、组织工程和基因治疗等新型治疗方法成为研究热点[5]，如生长因子和富血小板血浆 ( platelet-rich plasma，PRP ) 注射、干细胞移植等。但由于伦理学及社会因素限制，给药的剂量和方式、细胞的选择、疗效的评估、高成本等问题成为新型治疗不可避免的障碍。外泌体 ( exosomes，exos ) 是由细胞分泌的装载有多种生物活性物质的脂质双分子层囊泡，是细胞间进行信息交流的重要手段。外泌体能够传递大量生物活性物质到受损的细胞[6]，在维持椎间盘结构与功能的稳定方面发挥着重要的作用，目前已被广泛应用于 IVDD 的研究。笔者回顾了近 5 年来对外泌体的研究，结合热点话题分析总结了不同细胞来源的外泌体治疗 IVDD 的机制，以期为后续的深入研究提供新的思路。

一、外泌体的产生和功能

外泌体是细胞外囊泡 ( extracellular vesicles，EVs ) 的一个亚群，直径在 40～160 nm 之间[7]，由脂质双分子层包裹蛋白质及多种核酸如 DNA、长链非编码 RNA ( long noncoding RNA，LncRNA )、环状 RNA ( circular RNA，circRNA )、微小 RNA ( microRNA，miRNA )、信使 RNA( messenger RNA，mRNA ) 等组成。外泌体几乎存在于所有的细胞、组织和体液中，如血浆、尿液、唾液、关节液、母乳[8]。细胞外成分随着质膜的内陷与细胞表面蛋白一起进入细胞内，并在反式高尔基体网络和内质网的参与下形成早期分选内涵体 ( early sorting endosome，ESE )；ESEs 成熟为晚期分选内涵体 ( late-sorting endosome，LSE )；LSE 第二次内陷装载细胞内成分，胞内体囊泡( intraluminal vesicles，ILVs ) 产生；包含有 ILVs 的多囊泡体 ( multivesicular body，MVB ) 可直接与溶酶体融合发生降解，另一条途径便是和质膜直接融合释放内容物形成外泌体[9]。

外泌体的分子结构、内容物的组成和含量取决于亲本细胞类型、表观遗传修饰和众多环境因素，从而使其在各种组织环境及刺激下发挥不同的作用。外泌体最早发现时被认为是细胞的废弃物，但越来越多的证据表明，外泌体包含的各种细胞成分通过运输到受体细胞内发挥着重要的调节作用，甚至可作为载体将药物等治疗性物质递送到难以到达的组织中[10]。

二、外泌体可通过多种生物学机制改善 IVDD

1. 抑制内质网应激、调控增殖和凋亡：凋亡程序的过度激活导致的椎间盘细胞的死亡是 IVDD 的重要原因，因此抑制髓核的凋亡、促进增殖在防治 IVDD 中至关重要。Zhu 等[11]将骨髓间充质干细胞 ( bone marrow derived mesenchymal stem cell，BMSC ) 来源的外泌体与白细胞介素-1β ( interleukin-1β，IL-1β ) 诱导的小鼠退变髓核细胞 ( nucleus pulposus cells，NPCs ) 共同培养后，发现BMSCs-exos 包裹的 miR-142-3p 可通过靶向 MAP3k 混合谱系激酶 3 ( mixed lineage kinase 3，MLK3 ) 抑制丝裂原活化蛋白激酶 ( mitogen-activated protein kinase，MAPK ) 信号通路，抑制 IL-1β 诱导的 NPCs 的凋亡。人母系蛋白 3 ( matrilin-3，MATN3 ) 可促进转化生长因子-β( transforming growth factor-β，TGF-β ) 的解离和活化。Guo 等[12]首次发现人尿源性干细胞 ( urine-derived stem cell，USC ) 外泌体能通过转运 MATN3 蛋白提升 TGF-β 的含量，通过激活 TGF-β / SMAD 蛋白 ( drosophila mothers against decapentaplegic protein ) 途径和磷脂酰肌醇 3-激酶( phosphoinositide 3-kinase，PI3K ) - 蛋白激酶 B ( protein kinase B，AKT ) 通路来发挥促进细胞外基质 ( extracellular matrix，ECM ) 合成和 NPCs 增殖的作用。

机体缺氧、饥饿、炎症、蛋白质糖基化、Ca2+水平紊乱等均可在椎间盘中通过阻碍蛋白质的折叠或修饰诱发内质网应激，严重或长期的内质网应激过度激活未折叠蛋白反应 ( unfolded protein response，UPR )[13]，从而造成细胞的凋亡。转录激活因子 6 ( activating transcription factor 6，ATF6 ) 是 UPR 中的关键蛋白，受到刺激时可发挥转录因子活性，使内质网应激相关基因 C / EBP 同源蛋白 ( C / EBP homologous protein，CHOP )、葡萄糖调节蛋白 78 ( 78-kDa glucose regulated protein，GRP78 ) 和 X 盒结合蛋白 1( X boxbinding protein 1，XBP1 ) 表达上调，CHOP 是内质网应激诱导细胞凋亡信号通路中的重要介质，它的积累促进凋亡相关基因的表达以及蛋白酶的活化[14]。Xie 等[15]利用叔丁基过氧化氢处理终板软骨细胞 ( endplate chondrocyte，EPCs )，发现间充质干细胞 ( mesenchymal stem cell，MSC )来源的外泌体中的 miR-31-5p 可靶向负调控 ATF6，抑制EPCs 的凋亡和钙化。Xiang 等[16]通过蛋白质印迹实验和qRT-PCR 检测发现压力培养的 NPCs 中内质网应激标志物的表达增加，然而 USCs-exos 通过 AKT 和 ERK ( extracellular regulated protein kinases ) 信号通路显著抑制 UPR 的激活，降低 CHOP 表达，显著抑制细胞凋亡和延缓 IVDD 进程。Liao 等[17]用晚期糖基化终末产物 ( advanced glycation end products，AGEs ) 诱导人 NPCs，同样发现 BMSCs-exos 通过降低 CHOP 表达水平，抑制 caspase-12 和 caspase-3 的活化，进一步证实了外泌体抑制内质网应激介导的凋亡可能是延缓甚至逆转 IVDD 的有效途径。总之，外泌体可通过调节经典信号通路的活性及内质网相关基因的表达来维持椎间盘细胞数量的稳定，在椎间盘的再生和修复中发挥着重要作用，但具体的分子机制还需要进一步研究。

2. 抑制炎症反应，减少细胞焦亡：退变椎间盘细胞产生的炎症因子不仅可以诱导炎症细胞的聚集，还能上调基质分解代谢酶。细胞焦亡是一种与炎症相关的细胞死亡方式，常伴有各种促炎细胞因子的分泌[18]。NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白 3 ( NOD-like receptor thermal protein domain associated protein，NLRP3 ) 炎症小体是一种多蛋白复合物，可以招募并活化 caspase-1，进而激活下游的 GSDMD ( Gasdermin D ) 蛋白，后者可结合膜脂使孔道形成，引起胞膜的破裂和内容物的释放，是介导细胞焦亡的直接效应分子[19]。此外，caspase-1 可切割 pro-IL-1β 和pro-IL-18[20]，在 IL-1β 和 IL-18 的成熟和分泌以及细胞焦亡中均发挥重要的作用。

Zhang 等[21]在脂多糖诱导的 NPCs 模型中发现NLRP3、caspase-1、GSDMD 表达水平均显著增加，下游细胞因子 IL-18 和 IL-1β 随之增加。当与 MSCs-exos 共培养后这一现象发生了逆转。进一步研究证明，MSCs-exos中的 miR-410 可直接结合 NLRP3 mRNA，调控 NLRP3 /caspase-1 的级联反应，抑制了 NLRP3 介导的细胞焦亡。Yuan 等[22]发现人脐带 MSC 来源的外泌体中的 miR-26a-5p通过靶向甲基化转移酶 ( methyltransferase，MRTTL14 ) 阻断甲基化修饰来降低 NLRP3 表达水平，抑制 NPCs 的炎症反应和焦亡。Xing 等[23]提取了脂肪 MSC 的外泌体，并与热敏性脱细胞细胞外基质水凝胶偶联制备成可注射外泌体功能化细胞外基质水凝胶 ( dECM@exo )，与NPCs 共培养后，发现其能调控基质金属蛋白酶 ( matrix metalloproteinases，MMPs ) 的表达，并通过减轻炎症反应抑制细胞焦亡；此外，在大鼠模型的影像学结果中也观察到退变的椎间盘得到改善。该工程化外泌体为 IVDD 治疗提供了新的策略，可进一步开发进行临床研究。综上所述，NLRP3 的活化可放大炎症反应、促进 NPCs 的焦亡，而外泌体可通过抑制 NLRP3 的激活及其产物的活性有效地保护 NPCs。

3. 抵抗氧化应激 ( oxidative stress，OS )：OS 是指细胞氧化与抗氧化失衡 ( 偏向于氧化 )，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物的过程因子的表达，引起椎间盘细胞的凋亡和 ECM 成分的改变[24]。活性氧作为氧化剂常用于细胞 OS 的检测，它是一类不稳定、高活性分子，主要包括 O2-、OH-、H2O2、OCl-和 NO。椎间盘微环境的紊乱及外源性的刺激，如压力、促炎因子、高氧、高糖等，促进椎间盘中活性氧的产生，诱导 OS 并参与基质代谢、炎症、焦亡和凋亡等多种病理机制[25]。

Xia 等[26]通过共聚焦显微镜观察发现 NPC 中线粒体可摄取 BMSCs-exos，并通过基因本体论 ( gene ontology，GO ) 分析显示多种线粒体相关蛋白在 BMSCs-exos 中富集，这提示了 BMSCs-exos 可能通过维持线粒体功能，抑制线粒体活性氧介导的 TXNIP ( thioredoxin interacting protein )-NLRP3 的活化，减少 H2O2培养下大鼠 NPCs 的炎症和凋亡，从而抑制 IVDD。Hu 等[27]用 BMSCs-exos 处理压力诱导的大鼠 NPCs，通过检测活性氧水平以及线粒体膜电位，证明了 BMSCs-exos 通过抑制 OS，保护 NPCs 免受压力引起的线粒体损伤，减少细胞凋亡。转录因子 NF-E2相关因子 2 ( nclear factor erythroid2-related factor 2，Nrf2 )可促进抗氧化基因表达，通过激活 Nrf2 信号增加内源性抗氧化酶的合成，是抵抗 OS 的重要策略[24]。Xu 等[28]采用 H2O2处理小鼠 NPCs 建立 OS 模型，发现富血小板削减来源的外泌体中的 miR-141-3p 可降低 NPC 中 NLRP3、GSDMD、caspase-1 及炎症因子的表达水平，进一步的结果表明 miR-141-3p 通过靶向结合 Keap1 mRNA 的 3’UTR使其降解，促使 Nrf2 从 Keap1-Nrf2 复合物中释放并转位到细胞核中，实现抗氧化的生物学功能，从而抑制 OS 介导的炎症和焦亡，延缓 IVDD。

OS 是 IVDD 发生发展的重要原因，能够引起 NPCs 凋亡、ECM 分解代谢、炎症反应及细胞焦亡等一系列病理过程。外泌体以抗氧化应激作为靶点治疗 IVDD 或将成为未来非常具有前景的研究方向。

4. 调节细胞自噬：自噬是细胞在营养和能量缺乏、蛋白质积累、应激状态等情况下自我消化的过程，主要包括巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬[29]。巨自噬为常见的自噬类型，是将受损细胞器、蛋白质或病原体包裹在自噬体中，与溶酶体融合形成自噬溶酶体降解包裹的内容物，以实现细胞对自身代谢和能量的更新[30]。随着年龄的增长，退变椎间盘组织中的受损蛋白质和细胞器的积累、营养剥夺、缺氧等上调自噬，通过细胞内自我降解抵御这种不利改变[31]。

Xiao 等[32]利用脂多糖诱导大鼠 NPCs，通过 RT-qPCR和 ELISA 检测发现 BMSC-exos 可减少肿瘤坏死因子-α( tumor necrosis factor-α，TNF-α )、IL-1β 的释放，通过激活 AKT-mTOR 信号通路促进自噬，从而减少 NPC 凋亡。Shi 等[33]分离培养大鼠 NPCs，通过血清剥夺实验模拟人体椎间盘低血供病理模型，进一步研究发现 BMSCs-exos中 miR-155 通过靶向 Bach1 上调 HO-1 表达，从而激活自噬，抑制 NPCs 的凋亡。Chen 等[34]首次发现人脂肪 MSC来源的外泌体 miR-155-5p 可靶向 TGF-β Ⅱ 型受体，促进 NPC 自噬并减少细胞焦亡。软骨终板干细胞 ( cartilage endplate stem cells，CECs ) 在维持软骨终板 ( cartilaginous end plate，CEP ) 结构和功能的完整性方面具有重要的作用，通过促进 NPCs 再生和调节椎间盘的稳态有效控制IVDD。Luo 等[35]通过分析正常 CEP 来源的外泌体 ( CEP N-exos ) 和叔丁基过氧化氢 ( tert-butyl hydroperoxide，TBHP )诱导的退变 CEP 来源的外泌体 ( CEP D-exos ) 的生物信息学差异，发现 CEP N-exos 通过激活 PI3K / AKT / mTOR信号通路增强自噬，并通过体内和体外实验证实了 CEP N-exos 可改善 IVDD。Li 等[36]将人骨髓 MSC 来源的外泌体与 IL-1β 诱导的退变纤维环细胞共培养，发现 BMSCsexos 可通过抑制 PI3K / AKT / mTOR 信号通路介导的自噬来抑制纤维环细胞的炎症和凋亡。总之，外泌体可通过调节椎间盘细胞的自噬来响应外界不利因素的刺激，从而有效地减轻 IVDD。

5. 维持 ECM 的稳定：长期乳酸的积累会降低 CEP 通透性，改变 IVDD 中 pH 值，可破坏 ECM 的代谢平衡[37]。外泌体在酸性环境中仍能保持良好的生物活性，弥补了干细胞移植治疗 IVDD 的不足，并代替发挥重建椎间盘结构的作用。Li 等[38]发现在酸性环境中，BMSCs-exos 可维持软 ECM 的稳定，促进 Ⅱ 型胶原和蛋白聚糖的表达，下调 MMP-13 水平，保护 NPC 免受酸性环境诱导的凋亡，延缓 IVDD。Hingert 等[39]获取了严重下腰痛患者的退变椎间盘组织，在 3D 细胞培养模型中与人间充质干细胞( human mesenchymal stem cells，hMSC ) 来源的细胞外囊泡共培养，发现 2～4 周后活细胞的数量增加超过 50%，并且 hMSC 来源的细胞外囊泡可诱导退变的椎间盘软骨和ECM 的早期形成，通过对抗椎间盘微环境中炎症细胞因子和 MMPs 的破坏性作用来促进 IVDD 修复。由此可见，外泌体能够保护 ECM，且具有良好的稳定性，在退变椎间盘不利的微环境中仍可发挥较好的治疗作用。

6. 促进细胞的分化：干细胞移植作为治疗 IVDD 的新型细胞治疗方法，可直接解决退变椎间盘细胞减少的问题，然而干细胞的低存活率、伦理学及社会因素等限制了其临床普及[40]。已有大量研究表明，外泌体可促进细胞的分化，在继承了干细胞作用的基础上，不受退变椎间盘不利微环境的影响，受到了越来越多的关注[41-43]。

Lan 等[41]发现 NPC-exos 培养的 MSCs 中 Ⅱ 型胶原、聚集蛋白聚糖和 Sox9 的表达均显著增加，同时 NPC 标志物 CD24、KRT19 蛋白表达水平增加，证明了 NPCs-exos可促进 MSCs 向 NP 样细胞转化并迁移，且在此过程中Notch11 通路表达下调。GATA 结合蛋白 4 ( DATA binding protein 4，GATA4 ) 是一种 DNA 结合锌指转录因子，可以调节多种生物学过程，在促进增殖、成骨分化等方面发挥着重要作用[44]。Luo 等[42]通过体内和体外实验，证实了 SD 大鼠软骨终板的干细胞 ( CESCs ) 通过自分泌机制激活缺氧诱导因子-1α ( hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α ) /Wnt 信号通路，增加 GATA4 和 TGF-β1 的表达，从而促进CESCs 向 NPC 的侵袭、迁移和转分化。Zhang 等[43]发现髓核 MSC 来源的外泌体中 miR-15a 可通过 PI3K / AKT 和Wnt 3a / β-catenin 信号轴下调 MMP-3 等表达，维持了 ECM蛋白的平衡，促进了髓核 MSC 的成软骨分化。

随着细胞治疗、基因工程等新型治疗方法的不断深入，诱导干细胞分化成特定的组织细胞从而治疗退行性相关疾病一直是研究热点。外泌体能够促进干细胞向 NPC转化，或可为 IVDD 患者提供新的有效的治疗方式。

7. 抑制椎间盘内血管的生成：健康的椎间盘是无血管和神经的组织，在 IVDD 过程中，纤维环破损削弱了椎间盘的物理屏障作用，导致血管神经长入，促进免疫细胞和炎症因子浸润，从而打破了椎间盘的稳态，引起椎间盘源性下腰痛。因此抑制椎间盘内血管的侵入在缓解疼痛、提高患者的生活质量方面有着重要的意义。利用不同压力负荷培养大鼠脊索细胞 ( notochordal cell，NC )，发现 0.5 MPa 压力培养下 NC-exos 可抑制内皮细胞血管生成。通过进一步的体外迁移实验、小血管形成实验和增殖实验发现 0.5 MPa /NC-exos 的 miR-140-5p 可通过调节下游的 Wnt11 / β-catenin通路来抑制血管的生成[45]。Sun 等[46]将退变的纤维环细胞来源的外泌体 ( annulus fibrosus-exos，AF-exos ) 与人脐静脉内皮细胞 ( human umbilical vein endothelial cells，HUVECs )共培养，发现退变的 AF-exos 通过促进 HUVECs 迁移和 IL-6、TNF-α、MMP-3、MMP-13、血管内皮生长因子( vascular endothelial growth factor，VEGF ) 的表达发挥促血管化的作用，而未退变的纤维环细胞可通过分泌外泌体来阻止该现象的发生。目前，椎间盘血管化的机制仍有待深入探讨，而外泌体包裹丰富的生物活性物质，作为细胞间信息交流的重要载体发挥抑制椎间盘内血管生成的作用，在延缓 IVDD 的进程中具有巨大的潜力。

三、总结与展望

综上所述，外泌体作为促进 IVDD 再生和修复的一种潜在的新型无细胞疗法，包含其来源细胞的各种生物成分，且具有低免疫原性、生物屏障的渗透性、低细胞毒性和良好的稳定性[47]，在众多研究中已显示出了有效的促增殖和抗凋亡、抗 OS、抗炎、维持 ECM 稳态、促进分化和抑制血管再生的能力。然而，外泌体治疗 IVDD 的研究仍存在着许多难题。外泌体的分泌是一个高度受调控的过程，其组成和功能受源细胞的类型和培养条件的不同而有所差异，所以需要统一的标准来规划外泌体的生产、纯化和分离[48]；另外，外泌体的储存、转运对未来进一步的应用同样至关重要[49]。递送方式显著影响外泌体在体内的存在时间，体外实验多采用单次递送相同浓度的外泌体分析探讨其作用机制，但不能保证外泌体可在体内发挥长期效应，因此外泌体的最佳给药途径、给药剂量、合适的给药频率、方法和疗效的评估值得后续的深入研究[50]。外泌体的治疗效果主要来自于其包裹的物质如蛋白质、 miRNA，具体作用机制还需要进一步阐明。目前已有大量的研究结果证实了不同的 miRNA 对受体细胞的调控作用，其它外泌体成分如 LncRNA、circRNA 和蛋白质也有着广阔应用的前景，对 IVDD 的作用有望进一步去发掘。