基于网络药理学方法和分子对接技术分析胆通胶囊治疗胆汁淤积症作用机制

王钦，金智华，蔡亮亮

南通大学附属医院药学部，江苏 南通 226001

胆汁淤积症是指由胆汁分泌及排泄障碍所引起的一系列病理生理过程，临床表现为巩膜、皮肤颜色变黄，乏力，尿液颜色加深变黄，由于血清胆红素、胆汁酸水平升高，还会导致不同程度的皮肤瘙痒[1-2]。常见的病因有药物性肝炎、病毒性肝炎、胆结石、酒精性肝病、先天性胆管狭窄、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性疾病、转移性肝恶性肿瘤等。出现胆汁淤积症的症状后，应给予积极的对症处理和利胆药物治疗。可通过CT、超声、磁共振、肝穿刺活检等检查明确发生胆汁淤积的具体病因，从而给予对因治疗[3]。如果得不到妥善的治疗，胆汁淤积的情况持续加重，可能会对肝脏造成损伤，进展为肝纤维化与肝硬化[4-5]。

中医药治疗胆汁淤积症有较好的疗效，常用的具有疏肝利胆、清热化湿、消除黄疸功效的方剂有茵陈蒿汤、麻黄连翘赤小豆汤、大柴胡汤等，常用的中成药有茵栀黄颗粒、茵陈退黄胶囊、胆宁片、逍遥丸、龙胆泻肝丸、疏肝丸、消炎利胆片、柴胡疏肝丸等。胆通胶囊是南通大学附属医院的院内制剂，有清热利湿退黄、活血化瘀功效，适用于肝胆湿热型胆汁淤积症患者，还可用于慢性胆囊炎、胆管炎等疾病的治疗，主要组成为大黄、山楂2味中药的粉末，制备工艺简便，在南通大学附属医院临床中应用已有近30年的历史，临床疗效得到长期验证。为探寻胆通胶囊治疗胆汁淤积症的药理学作用机制，本研究将网络药理学方法与分子对接技术相结合，以期能为胆通胶囊的临床应用提供研究数据和理论依据。

1 资料与方法

1.1 化学成分收集和药物靶点获取 将胆通胶囊中的“大黄”输入中药系统药理数据库和分析平台（TCMSP）数据库（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中收集所有化合物成分，再根据药物代谢动力学原理，以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性指数（DL）≥0.18 为筛选标准，获取同时符合以上2 个条件的所有化合物。由于TCMSP 数据库未收录“山楂”，因而山楂的化学成分在本草组鉴（HERB）数据库（http：//herb.ac.cn/）中查找。大黄、山楂的靶点数据来源于PharmMapper 数据库（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/），使用Uniprot 数据库（https：//www.uniprot.org/）对获取的药物靶点名称进行标准化。

1.2 获取胆汁淤积症的靶点 在GeneCards 数据库（https：//www. genecards. org/）中， 物种选择“人”（Homo sapiens），并以“Cholestasis”为关键词筛选胆汁淤积症的靶点。

1.3 获取药物-疾病的交集靶点 将1.1项、1.2项中获取的药物靶点基因与疾病靶点基因分别输入VENNY 2.1 工具（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），获取药物-疾病的交集靶点，绘制出韦恩图。

1.4 构建胆通胶囊单味药活性成分-靶点网络 利用Cytoscape 3.10.0 软件构建胆通胶囊活性成分-靶点网络，各节点代表胆通胶囊所含大黄、山楂的活性成分及靶点，各个边则代表活性成分与靶点之间的相互作用。其中度值较高者为胆通胶囊的主要活性成分。

1.5 构建蛋白质相互作用（PPI）网络 将胆通胶囊的活性成分、药物-疾病的交集靶点通过STRING数据库（https：//cn.string-db.org/）与Cytoscape 3.10.0 软件进行PPI 网络分析。将药物-疾病的交集靶点输入STRING 数据库的“Multiple proteins”，物种选择“Homo sapiens”， meaning of network edges 选择“evidence”，隐去网络中游离的靶点，minimum required interaction score 选择“high confidence”，导出TSV 格式的“source-target” 数据表。 应用Cytoscape 3.10.0 软件打开TSV 数据表，利用Network Analyze 插件构建PPI 网络图，选取度值较高的靶点作为核心靶点[6]。

1.6 基因本体论（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析 利用DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp）对核心靶点进行GO 功能富集分析，获得胆通胶囊治疗胆汁淤积症的主要生物功能。对核心靶点进行KEGG通路富集分析，获得胆通胶囊治疗胆汁淤积症的主要信号通路。P＜0.05 表示富集分析结果具有统计学差异，选择P＜0.05且P值较低的前30个主要信号通路，在微生信工具网站（https：//www.bioinformatics.com.cn/）制作富集分析图[6]。

1.7 分子对接 将1.4项筛选的胆通胶囊主要活性成分与1.5 项筛选的核心靶点进行分子对接验证。在PubChem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查询胆通胶囊主要活性成分的化学结构式，并保存为SDF 文件格式。将SDF 文件导入ChemBio3D Ultra 14.0.0117 软件中，应用MM2 算法得到能量最低的三维结构式，保存为MOL2 格式。在蛋白质结构（PDB）数据库（https：//www.rcsb.org/）下载核心靶点蛋白的三维结构图，保存为PDB 文件格式。应用PyMol 2.5.5软件删除核心靶点蛋白结构中的小分子配体与水分子，导入AutoDockTools 1.5.7 软件进行加氢等处理，将主要活性成分与核心靶点蛋白的结构转换为PDBQT 文件格式，并确定每种核心靶点蛋白的活性口袋坐标参数。最后使用AutoDock Vina 软件对主要活性成分与核心靶点蛋白进行分子对接，保存最低结合能的对接数据。结合能越低说明化学物质和蛋白的结合能力越强，通常认为结合能＜-5.0 kcal/mol时结合活性较好[7-8]。

2 研究结果

2.1 胆通胶囊活性成分 共收集胆通胶囊的活性成分25 个，预测靶点434 个。胆通胶囊各活性成分基本信息见表1。

表1 胆通胶囊的活性成分

2.2 胆汁淤积症靶点 在GeneCards 数据库中以“Cholestasis”为关键词进行检索，共获得疾病靶点1 039个，将其作为候选靶点来源。

2.3 药物-疾病交集靶点 得到92个药物-疾病的交集靶点，韦恩图见图1。

图1 胆通胶囊-胆汁淤积症交集靶点韦恩图

2.4 胆通胶囊活性成分-靶点网络 运用Cytoscape 3.10.0 软件的Network Analyze 插件构建胆通胶囊活性成分-靶点网络图，见图2。外侧环形排列的淡蓝色节点为药物-疾病的交集靶点，环形内的橙色、绿色节点分别为大黄、山楂的活性成分。每条边表明药物主要活性成分与交集靶点存在的关系。可见，1 个药物活性成分往往与多个交集靶点有关，1 个交集靶点也往往对应多个药物活性成分，而这些活性成分又属于不同的中药，这表明胆通胶囊治疗胆汁淤积症是通过多靶点、多成分、多重通路发挥作用的。

图2 胆通胶囊活性成分-靶点网络图

胆通胶囊的活性成分中，苏齐内酯、决明内酯、番泻苷E、20-殷金醇棕榈酸、（-）-儿茶素和棕榈胺A 有较高的度值，为胆通胶囊的主要活性成分，见表2。

表2 胆通胶囊的主要活性成分

2.5 PPI网络构建 应用STRING 数据库与Cytoscape 3.10.0 软件构建药物-疾病PPI 网络图（见图3）。图中各个节点代表交集蛋白，各个边代表蛋白之间的相互作用，度值越高，表明该蛋白与别的蛋白之间的关系越紧密。

图3 胆通胶囊-胆汁淤积症PPI网络图

将STRING 数据库生成的TSV 文件导出至Cytoscape 3.10.0 软件，应用CytoHubba 插件对蛋白的关键性进行分析，越靠近中心、颜色越深的蛋白，其关键性越高。白蛋白（ALB）、有丝分裂原-活化蛋白激酶1（MAPK1）、类视黄醇X 受体α（RXRA）、HRas 原癌基因、三磷酸鸟苷（GTP）酶（HRAS）、胰岛素样生长因子1（IGF1）、雌激素受体1（ESR1）、内皮一氧化氮合成酶3（NOS3）、ras 同源物家族成员A（RHOA）等蛋白在PPI 网络中的度值最高，表明以上蛋白是胆通胶囊治疗胆汁淤积症的核心靶点。

2.6 核心靶点的GO 功能富集分析结果 见图4。药物-疾病交集靶点在人体内主要参与精氨酸分解代谢（Arginine catabolic process）、尿素循环（Urea cycle）、雌激素反应（Response to estrogen）、嗜苯胺蓝颗粒腔（Azurophil granule lumen）、富纤维胶凝蛋白1 颗粒腔（Ficolin-1-rich granule lumen）、血液微粒（Blood microparticle）、精氨酸酶活性（Arginase activity）、类固醇激素受体（Steroid hormone receptor activity），以及RNA 聚合酶Ⅱ转录因子活性，配体激活的序列特异性DNA 结合（RNA polymeraseⅡtranscription factor activity，ligand-activated sequence-specific DNA binding）等生物过程。

图4 GO功能富集分析图

2.7 核心靶点的KEGG 通路富集分析结果 见图5。显示交集靶点在体内主要涉及精氨酸生物合成（Arginine biosynthesis）、甲状腺癌（Thyroid cancer）、血管内皮生长因子（VEGF）信号通路（VEGF signaling pathway）、内分泌抵抗（Endocrine resistance）、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）、 催乳素信号通路（Prolactin signaling pathway）、黑色素瘤（Melanoma）、胶质瘤（Glioma）等信号通路。

图5 KEGG通路富集分析图

2.8 分子对接验证结果 将2.4项筛选的胆通胶囊主要活性成分与2.5 项筛选的核心靶点蛋白进行分子对接，见表3 和图6。胆通胶囊主要活性成分与核心靶点蛋白的结合能均小于-5.0 kcal/mol，提示均有较好的结合活性。胆通胶囊的主要活性成分可对核心靶点蛋白发挥调控作用。

图6 主要活性成分与核心靶点蛋白的分子对接图

表3 主要活性成分与核心靶点蛋白的对接结合能 kcal/mol

3 讨论

胆汁淤积症归属于中医学瘟黄范畴，常见病机为湿热蕴结于肝胆，气机不畅，导致胆汁排泄失常，出现胆汁淤积，气机郁滞日久则可导致血行瘀阻。对于以上病因导致的胆汁淤积症患者，治则应以清热利湿退黄、活血化瘀为主。胆通胶囊的主要成分为大黄、山楂2味中药的粉末，有清热利湿退黄、活血化瘀功效。大黄具有泻下攻积、清热凉血、泻火解毒、疏肝利胆、逐瘀通经、利湿退黄等功效，可用于治疗血热出血、积滞便秘、胃肠积滞、痈肿疔疮、湿热黄疸、产后瘀阻、瘀血经闭等症。大黄含有的主要成分为游离型与结合型蒽醌/蒽酮类、苯丁酮类、黄酮类、二苯乙烯类和色原酮类等[9]。大黄中的结合型蒽醌/蒽酮类化合物具有泻下作用，而游离型蒽醌类化合物有清热、利湿、退黄作用[10]。大黄可使大鼠的胆汁排泄能力显著增强[11]，大黄中的大黄酸、大黄素等化合物能扩张胆管，促进分泌胆汁，防止肝坏死，舒张奥狄氏括约肌[12]。本研究获得的大黄主要活性成分为决明内酯、番泻苷E、（-）-儿茶素和棕榈胺A，属于游离型蒽醌类化合物。Seo Y 等[13]的研究报道指出，决明内酯对叔丁基氢过氧化物诱导的HepG2 细胞死亡具有很明显的肝保护作用，这种肝保护作用是通过核因子-红细胞2 相关因子2（Nrf2）依赖的抗氧化信号通路发挥的。Le JM 等[14]撰写的综述介绍了番泻苷具有多种药理学特性，如缓解乏力、抗肥胖、降血糖、保护肝脏、抗纤维化、抗炎症、抗肿瘤和抗神经退行性疾病。儿茶素是黄酮类化合物，是活性氧清除剂和金属离子螯合剂，具有抗氧化活性，其机制主要包括抑制前氧化酶以及诱导产生抗氧化酶，可预防和治疗氧化应激引起的疾病[15]。

山楂具有活血化瘀、健脾开胃、行气散瘀、消食导滞等功效，使湿热之邪从二便分消，可用于治疗胃脘胀满、肉食积滞、腹痛泻痢、疝气疼痛等症[16]。山楂含有的主要成分为黄酮类和三萜类等[17]。本研究获得的山楂主要活性成分为苏齐内酯和20-殷金醇棕榈酸。Pei HM 等[18]发现，山楂中的牡荆苷7-葡萄糖苷、苏齐内酯和20-殷金醇棕榈酸等均是治疗消化不良的主要活性化合物，涉及环加氧酶2（PTGS2）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、MAPK1、有丝分裂原-活化蛋白激酶3（MAPK3）、ESR1 等核心靶点，其分子机制主要与减轻炎症反应、促进细胞增殖和存活、增加肠道水分、促进肠道运动有关。林道斌等[19]发现山楂中的主要活性成分可通过抑制炎症因子表达、抗氧化应激反应等机制，作用于环加氧酶1（PTGS1）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG）、NOS3、丝氨酸蛋白酶1（PRSS1）、B型单胺氧化酶（MAOB）等靶点，发挥肝保护作用，可用于治疗非酒精性脂肪性肝病。

HRAS为一种GTP酶，结合GTP 后，会与丝苏氨酸蛋白（Raf）激酶结合，进一步激活有丝分裂原-活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶（MAPK/ERK）通路。MAPK1 是MAPK 家族的一个成员，是多种生物化学信号的整合点，经上游激酶的磷酸化激活后，可参与到细胞的转录调控、增殖、分化与发育等多种过程。Xiang D 等[20]研究了雌激素导致的胆汁淤积诱导的肝脏、肠道损伤与细胞信号转导的关联，诱导雌激素胆汁淤积大鼠发生肝脏炎症，包括肠道和肝脏发生氧化应激和肝脏、肠道细胞凋亡，参与激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）和MAPK 信号通路。

RXRA 是人类的核受体，参与视黄酸介导的基因激活，进而介导类视黄醇的生化效应[21]。类视黄醇X受体（RXR）是胆汁形成的转录调节因子，是目前正在研究的胆汁淤积疾病的治疗靶点[22]。有研究表明，雄性SD 大鼠接受胆道结扎后，观察到肝脏中的多重耐药相关蛋白2（Mrp2）下调，白细胞介素-1β（IL-1β）上调，这与肝脏RXRA 蛋白水平的下调和结合Mrp2启动子顺式元件有关；经过治疗后，肝细胞的IL-1β、Mrp2 和RXRA 的表达趋于正常水平，可见发生阻塞性胆汁淤积时，肝脏中Mrp2、IL-1β参与的特异性调节与RXRA的细胞因子依赖性改变有关[23]。

IGF1 是一种在肝脏中产生的具有内分泌特性的单链多肽，生长激素可促进IGF1 的生成，机体内有多种细胞具有IGF1 受体。IGF1 受体与细胞应激、衰老有关，参与肝脏疾病的发病过程[24]。Cadoret A 等[25]通过肝脏特异性IGF1 基因敲除小鼠胆管结扎诱导胆汁淤积性肝损伤，与对照组相比，基因敲除小鼠表现出较少的胆管结扎诱导的肝细胞损伤，但血清胆汁酸水平比较，两者没有统计学差异；基因敲除小鼠的细胞角蛋白19、转化生长因子β1、α-平滑肌肌动蛋白和Ⅰ型胶原蛋白α1 的表达水平均低于对照组，表明基因敲除后胆汁淤积耐受性降低，纤维化反应增加，因此，IGF1 蛋白参与了胆汁淤积性肝应激损伤。

NOS3 主要参与脯氨酸、精氨酸的代谢，代谢产物有一氧化氮（NO）[26]。NO 是一种内皮松弛因子，具有舒张血管、抑制血管平滑肌细胞增殖、抑制白细胞黏附等功能，参与多种疾病的病理过程[27]。Wang Y 等[28]探讨了内皮NO 合成酶（NOS）和妊娠期肝内胆汁淤积之间的关联，测定了母体血浆NOS 水平、胎盘mRNA 水平和NOS 的细胞特异定位，采用多元线性回归模型确定血清总胆汁酸的独立因素；结果表明NOS 在胎盘血管灌注不良和不良妊娠结局中起重要作用，因而NOS 可预测妊娠期肝内胆汁淤积的严重程度。

RHOA 是一种小GTP 酶的ras 同源物家族成员（RHO）家族成员，在信号转导级联中发挥分子开关的功能[29]。Zhou Q 等[30]进行了一项关于RHOA/RHO激酶介导调节肝硬化大鼠肝内血管张力的研究，发现胆管结扎术诱导肝硬化大鼠的肝RHOA、RHO 激酶表达水平增加，因而认为RHOA、RHO 激酶的上调增加了肝硬化大鼠的肝内阻力，提高了肝脏对血管收缩剂的敏感性。

通过以上文献报道可发现，运用网络药理学方法筛选出的核心靶点与胆汁淤积症的发病过程有关联。而分子对接的结果表明，胆通胶囊的主要活性成分可对ALB、MAPK1、RXRA、HRAS、IGF1、ESR1、NOS3、RHOA 蛋白发挥调控作用，初步阐明了胆通胶囊疗效的机制，为后续的实验研究提供参考。

综上所述，胆通胶囊可通过多种活性成分作用于胆汁淤积症的多个靶点，发挥多通路治疗的作用。南通大学附属医院制剂室近年来致力于开发皮肤科外用制剂和中药制剂[31-32]，网络药理学和分子对接技术给新制剂的开发、研究提供了除动物实验、临床试验以外的科学研究手段。