基于网络药理学与分子对接技术探讨滋肾养血活血汤治疗胚胎反复种植失败作用机制

宋红艳，何东杰，石少琦，崔天薇，卫爱武

1. 河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000

2. 河南中医药大学第一临床医学院，河南 郑州 450000

近年来，随着辅助生殖技术的不断完善和提高，胚胎移植手术中，胚胎质量得到明显改善，但临床工作中，许多移植优质胚胎的患者仍不能获得成功妊娠，胚胎反复种植失败（RIF）已成为影响辅助生殖技术妊娠结局的重要因素。2018 年，我国《胚胎植入前遗传学诊断/筛查技术专家共识》将RIF 定义为移植3 次及以上或移植高评分卵裂期胚胎数4～6 个或高评分囊胚数3 个及以上[1]。RIF 的确切病因尚不明确，大多数RIF 与母体子宫内膜异常等因素有关[2-3]。RIF 归属于中医学不孕、滑胎等范畴。卫爱武教授多年临床经验显示，RIF 患者多表现为肾虚血瘀证。卫教授以滋肾活血、养血填精为法，拟定滋肾养血活血汤，其能有效改善肾虚血瘀型RIF患者的临床妊娠率和胚胎种植率，然而滋肾养血活血汤治疗RIF 的作用机制尚不明确。本研究应用网络药理学方法筛选滋肾养血活血汤治疗RIF的作用靶点，并结合分子对接技术对相关作用靶点进行验证，以期探讨滋肾养血活血汤治疗RIF的作用机制。

1 研究方法

1.1 滋肾养血活血汤活性成分与靶点筛选 在中药系统药理数据库和分析平台（TCMSP，https：//tcmspe.com）检索滋肾养血活血汤药物组成（菟丝子、女贞子、金樱子、熟地黄、当归、枸杞子、丹参）有效活性成分，以口服生物利用度（OB）≥30% 和类药性（DL）≥0.18作为筛选条件进行筛选，然后在Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）进行蛋白与基因转化，最终获得滋肾养血活血汤的有效活性成分与潜在基因靶点。

1.2 RIF疾病靶点筛选 在GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）和OMIM 数据库（https：//omim.org/）以“recurrent implantation failure”为关键词进行检索并筛选RIF的疾病靶点，设定物种为人，以相关度的中位数＞6.0 为标准筛选靶点，将以上2 个数据库检索获得的信息去重汇总后建立RIF 疾病靶点数据库。

1.3 中药-活性成分-靶点网络构建 利用Venny2.1.0在线工具对药物靶点及疾病靶点取交集并绘制韦恩图，将获取的交集靶点导入String 数据库（https：//cn.string-db.org/）绘制蛋白质-蛋白质互作（PPI）网络，然后利用Cytoscape3.9.1 软件中的CytoNCA 插件进行网络结构的拓扑分析，以获取交集核心靶点，并绘制“中药-活性成分-靶点”网络图。

1.4 基因本体（GO）与京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析 通过DAVID 在线数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）对核心靶点进行GO 与KEGG 富集分析。设置物种类型为“Homo sapiens”，下载GO 与KEGG 富集分析结果，利用微生信在线平台（https：//www.bioinformatics.com.cn/）绘制气泡图及条形图进行可视化。

1.5 分子对接验证 基于交集靶蛋白PPI 网络图的网络拓扑结构，筛选出度（degree）值排名前9的靶点，同时根据“中药-活性成分-靶点”网络图，筛选出degree 值排名前5 的活性成分。将筛选出的靶标和活性成分进行分子对接。在TCMSP 数据库筛选并下载核心化合物的二维结构，在PDB（https：//www.rcsb.org/）数据库中下载核心靶点受体蛋白的三维晶体结构，使用Pymol 软件精简冗杂结构，再利用AutoDock Vina1.5.7 对PDB 蛋白分子进行处理；使用AutoDock Vina 对关键活性成分和核心靶点蛋白进行分子对接验证，并计算结合能，结合能越小则对接越紧密。最后利用Pymol 软件对结合紧密的部分进行可视化构图。

2 研究结果

2.1 滋肾养血活血汤有效成分 通过检索TCMSP 数据库，共获得滋肾养血活血汤787个化学成分。其中菟丝子29 个、熟地黄76 个、当归125 个、女贞子119个、金樱子48个、枸杞子188个、丹参202个。以OB≥30%和DL≥0.18 为有效性筛选条件，共筛选获得146 个有效活性成分。其中菟丝子11 个、熟地黄2 个、当归2 个、女贞子13 个、金樱子8 个、枸杞子45个、丹参65个。

2.2 滋肾养血活血汤有效成分潜在靶点 通过TCMSP数据库对146个药物有效活性成分相关潜在靶点进行搜索，共计获得2 227 个潜在靶点。其中菟丝子314 个、熟地黄33 个、当归34 个、女贞子332 个、金樱子277 个、枸杞子349 个、丹参888 个。其中部分中药具有相同的活性成分，去除重复成分及靶点后共得到122 个药物有效活性成分和256 个潜在靶点。利用Cytoscape3.9.1 软件构建滋肾养血活血汤中药-活性成分-靶点图，见图1。图中节点大小与degree 值大小相对应，节点越大则degree 值越大，共得到372 个节点，1 548 条边。其中degree 值排名前5 的活性成分分别是：MOL000098（槲皮素），degree值154； MOL000422（山柰酚）， degree 值63；MOL000006（木犀草素），degree值57；MOL000358（β-谷甾醇），degree 值40；MOL007154（丹参酮ⅡA），degree值39。

图1 中药-活性成分-靶点网络图

2.3 RIF 疾病靶点 OMIM 数据库共获得545 个RIF疾病靶点，GeneCards 数据库共获得到6 944个RIF 疾病靶点，以相关度的中位数＞6.0 为标准，筛选获得1 735 个RIF 疾病靶点，合并OMIM 数据库与GeneCards 数据库获得的RIF 疾病靶点，并删除重复部分，最终获得RIF疾病靶点2 215个。

2.4 PPI 网络构建 滋肾养血活血汤药物潜在靶点及RIF 疾病靶点取交集并绘制韦恩图，见图2。将获取的交集靶点导入String 数据库，共获得140 个节点和2 861 个边，平均点值为40.9，绘制PPI 网络图，见图3。然后利用Cytoscape3.9.1软件中的Centiscape2.2插件进行网络结构的拓扑分析，以degree 值＞40.8、Betweenness＞107.4、Closeness＞0.004 为标准，获得核心靶点36个，见图4。其中包含36个节点和568个边，degree 值排在前9 的核心靶点分别为白细胞介素（IL）-6、缺氧诱导因子（HIF）-1A、血管内皮生长因子A（VEGFA）、IL-1B、β-谷甾醇与蛋白激酶B1（AKT1）、前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、肿瘤坏死因子（TNF）、信号转导和转录激活因子3（STAT3）、TP53。

图2 药物靶点与疾病靶点韦恩图

图3 PPI网络图

图4 核心靶点筛选过程图

2.5 GO 富集分析 将获得的交集核心靶点录入DAVID 数据库，进行GO 富集分析，取P＜0.05，其中生物过程（BP）340条，包括基因表达调控、血管生成、细胞对缺氧的反应及细胞凋亡等，细胞组分（CC）21 条，涉及大分子复合物、细胞外空间、胞外区、染色质等，分子功能（MF）54 条主要涉及蛋白激酶/蛋白磷酸酶结合、蛋白结合及酶结合等。利用微生信在线平台导入BP、CC、MF 排名前10的条目，制作生物过程富集气泡图，见图5。

图5 GO富集分析

2.6 KEGG 富集分析 在DAVID 数据库对滋肾养血活血汤和RIF 的36 个核心靶点进行KEGG 富集分析，取P＜0.05，筛选获得117 个信号通路。取前20 个显著富集的信号通路进行可视化分析，见图6。KEGG富集分析的通路主要分布在癌症通路、炎症系统及疾病相关通路及信号传导通路中，其中信号传导通路有34 个，如HIF-1 信号通路、TNF 信号通路、磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、Toll 样受体信号通路、叉头框蛋白O（FoxO）信号通路、p53 信号通路、VEGF信号通路等，均与RIF的发病机制相关，见图7。将信号传导通路和对应基因靶点导入Cytoscape3.9.1软件，进行药物-活性成分-核心靶点-信号传导通路可视化分析，见图8。其中包含186 个节点，488条边。

图6 KEGG富集分析

图7 KEGG富集分析中信号传导通路分析结果

图8 药物-活性成分-核心靶点-信号传导通路网络图

2.7 分子对接验证 对中药-活性成分-靶点网络中degree 值排名前5 的主要药物有效活性成分（木犀草素、β-谷甾醇、丹参酮ⅡA、槲皮素、山柰酚）与degree 值排名前9 的疾病关键靶点（IL-6、HIF-1A、VEGFA、 IL-1B、 AKT1、 PTGS2、 TNF、 STAT3、TP53）进行分子对接验证，并计算结合能，对结合能最低的4对组合进行可视化构图。滋肾养血活血汤的主要活性成分与RIF的疾病关键靶点蛋白的结合能均小于-2 kcal/mol，见表1。其中β-谷甾醇与AKT1、丹参酮ⅡA与HIF-1A、丹参酮ⅡA与TNF、槲皮素与HIF-1A对接活性较好，见图9。

表1 药物主要活性成分与疾病关键靶点结合能 kcal/mol

图9 药物主要活性成分与疾病关键靶点对接示意图

3 讨论

滋肾养血活血汤由菟丝子、丹参、熟地黄、枸杞子、女贞子、金樱子、当归组成。方中菟丝子滋补肝肾，益精养血安胎。丹参活血调经，《本草纲目》谓其“能破宿血，补新血”，《日华子本草》指出丹参能“安生胎，落死胎，止血崩、带下，调妇人经脉不匀”。丹参与菟丝子合用，一补一泻，滋肾与活血同调，共为君药。熟地黄补阴益精以养血，为臣药。枸杞子与女贞子滋补肝肾。金樱子固精秘气，与菟丝子合用有固精敛胎之效。当归养血活血，助丹参逐瘀安胎。诸药合用，共奏滋肾填精、养血活血、逐瘀养胎之效。

本研究利用网络药理学筛选出滋肾养血活血汤有效活性成分及有效活性成分与RIF疾病靶点，构建PPI 网络，运用基因生物过程富集分析及通路预测等方法，获得槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、丹参酮ⅡA 这5 种核心活性成分。槲皮素是一种天然黄酮类化合物，能够调节多种靶点和信号通路，起到一定的妊娠保护作用[4]。有研究指出，槲皮素可降低IL-6、IL-8 等炎性因子水平，升高血红素氧合酶1（HO-1）水平，恢复母胎界面免疫动态平衡[5]。槲皮素还能增加妊娠小鼠的雌二醇水平，并可通过多途径、多基因的基因表达，下调半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的活性，从而提高子宫容受性，发挥抗妊娠丢失的作用[6]。木犀草素能影响多条信号通路发挥药理作用，如抑制脂多糖诱导的巨噬细胞产生IL-6、TNF-α 等炎症因子的表达，促进血管内皮生长因子的表达等[7-8]。β-谷甾醇是一种天然植物甾醇，具有显著的抗氧化作用，研究发现其可抑制脂多糖诱导的TNF-α、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）等炎性介质的释放[9-11]。丹参酮ⅡA 可能通过抑制TRL4/髓样分化因子88（MyD88）/核因子-κB（NF-κB）信号通路，增加子宫内膜胞饮突的表达，改善子宫内膜容受性[12]。山柰酚具有抗氧化、抗病毒、调节免疫及抗肿瘤等功效[13]。菟丝子的有效成分可能通过激活STAT3 信号通路改善大鼠种植窗期子宫内膜容受性[14]。丹参酮是丹参的主要提取物，丹参酮ⅡA 可以提升小鼠VEGF 和血管形成素-1（Ang-1）阳性细胞数及同源盒A10（HOXA10）、白血病抑制因子（LIF）水平，促进血管生成，从而改善子宫内膜容受性，有助于小鼠胚泡植入[15]。由此推测，滋肾养血活血汤可能通过药物主要活性成分调节RIF 患者母胎界面免疫耐受、血管重塑、子宫内膜容受性等以促进胚胎着床。

KEGG 富集分析显示，滋肾养血活血汤治疗RIF的核心靶点主要涉及的信号通路有HIF-1 信号通路、TNF 信号通路、PI3K-AKT 信号通路、VEGF 信号通路等，而RIF 的发生与胚胎质量、母胎界面接受程度、免疫细胞有密切的关系，涉及炎症细胞、免疫耐受、血管生成等多种因素的参与与调控[16-19]。其中HIF-1 信号通路为富集程度较高的信号传导通路，HIF-1 信号通路中涉及的靶基因有IL-6、HIF-1A 及VEGF 等，广泛参与炎症反应、血管形成、细胞增殖和迁移。研究显示，RIF 患者分泌中期孕酮诱导阻断因子1（PIBF1）呈显著低表达，而低表达的PIBF1 可通过下调IL-6 抑制子宫内膜间质细胞增殖及蜕膜化，提示这可能是RIF 发生的主要原因之一[20]。且在体外受精-胚胎移植（IVF）中已证明IL-6 可促进滋养层细胞的分裂和附着，加速其侵袭和迁移，有助于胚胎着床和妊娠维持[21]。缺氧的子宫内环境可诱导合成HIF-1A，提高子宫内膜容受性，有助于胚胎的植入[22]。RIF 患者子宫内膜中的HIF-1A 表达下调，微血管密度明显降低，表明子宫内膜HIF-1A 表达和血管生成量的降低可能导致植入失败[23]。VEGF 家族是已知的调控血管构造及生成的重要因子，VEGF 表达降低可导致血管生成不足，可能是导致RIF 的原因[24]。综上，推测滋肾养血活血汤可能通过多成分、多靶点调控HIF-1 信号通路调节炎症反应、血管形成、细胞增殖与迁移，发挥治疗RIF的作用。

分子对接中，受体和配体之间的结合能越低则结合构象越稳定，其互作的可能性随着结合能的降低而增加[25]。而当结合能小于-5 kcal/mol 时，两者具有较强的结合活性[26]。本研究中分子对接发现，药物主要活性成分与关键靶点间结合能均为负值，且主要以氢键结合方式进行相互作用，验证了网络药理学预测得到的滋肾养血活血汤主要活性成分与关键靶点均具有一定的结合能力的结论，尤其是β-谷甾醇与AKT1、丹参酮ⅡA 与HIF-1A、丹参酮ⅡA 与TNF、槲皮素与HIF-1A。

综上所述，滋肾养血活血汤治疗RIF的作用机制可能通过其活性成分β-谷甾醇、丹参酮ⅡA 等与靶蛋白（IL-6、HIF-1A、VEGFA、IL-1B、AKT1 等）相互结合，进而调控多种信号传导通路发挥生物学作用。同时，本研究利用网络药理学方法已经筛选出HIF-1 信号通路、TNF 信号通路、PI3K-AKT 信号通路、VEGF 信号通路等，在后续的体内实验及细胞水平体外实验中将进一步验证。因此希望通过继续挖掘相关内容，并进行生物学实验对滋肾养血活血汤治疗RIF的作用机制进行进一步的阐释。