异氟醚通过BMP4/Smad信号通路对自发性高血压大鼠脑损伤的作用机制研究

杨雪梅，杨康明，李娜

摘要 目的：探究异氟醚通过调节骨发生形态蛋白4（BMP4）及其下游Smad蛋白对自发性高血压大鼠（SHR）脑损伤的作用机制。方法：采用随机数字表法将48只SHR分为模型组、异氟醚组、阳性药物组、异氟醚＋LDN193189组，健康大鼠作为健康对照组，每组12只。各组大鼠分别放入氧气箱中，健康对照组、模型组、阳性药物组大鼠通入特殊气体（30%O2、70%N2）1 h，异氟醚组、异氟醚＋LDN193189组通入混杂2%异氟醚的特殊气体1 h，通过麻醉气体检测仪检测异氟醚含量，确保异氟醚浓度始终保持在2%。通气结束后，异氟醚＋LDN193189组大鼠腹腔内注射BMP4/Smad通路抑制剂溶液20 μL（LDN193189，5 mg/kg），阳性药物组大鼠腹腔内注射缬沙坦溶液20 μL（10 mg/kg），健康对照组、模型组、异氟醚组大鼠腹腔内注射等量的生理盐水。氧气箱通气实验及注射每日1次，持续10 d。无创血压检测仪检测尾动脉收缩压变化；神经学行为评分评价行为功能；脑含水量检测脑水肿程度；原位末端转移酶标记法（TUNEL）染色和尼氏染色观察海马组织病理学变化及神经元损伤情况；荧光定量聚合酶链式反应（PCR）及蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测海马组织BMP4、Smad2 mRNA及蛋白表达水平。结果：与模型组比较，异氟醚组、阳性药物组、异氟醚＋LDN193189组大鼠海马神经细胞凋亡减少，尼氏小体增多，血压、神经学评分、脑组织含水量显著降低，BMP4、Smad2 mRNA及蛋白表达量显著升高（P＜0.05）；与异氟醚组比较，异氟醚＋LDN193189组大鼠神经细胞凋亡增多，尼氏小体急剧减少，血压、神经学评分、脑组织含水量显著升高，BMP4、Smad2 mRNA及蛋白表达量显著降低（P＜0.05）；异氟醚组与阳性药物组各项数据差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论：异氟醚可通过促进BMP4/Smad信号通路减轻SHR脑损伤。

关键词自发性高血压；脑损伤；异氟醚；骨发生形态蛋白4；Smad蛋白

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.04.010

Effect of Isoflurane on Cerebral Injury in Spontaneously Hypertensive Rats through BMP4/Smad Signaling Pathway

YANG Xuemei， YANG Kangming， LI Na

Ganzi Tibetan Autonomous Prefecture People′s Hospital， Ganzi 626000， Sichuan， China

Corresponding AuthorLI Na， E-mail： iw12pf@163.com

AbstractObjective：To explore the effect of isoflurane on brain injury in spontaneously hypertensive rats（SHR） by regulating bone morphogenetic protein 4（BMP4） and its downstream Smad protein.Methods：Forty-eight SHR rats were randomly divided into model group，isoflurane group，positive drug group，isoflurane＋LDN193189 group，and healthy rats were used as healthy control group，with 12 rats in each group.Rats in each group were placed into oxygen tanks，healthy control group，model group and positive drug group were injected with special gas（30%O2，70%N2） for 1 h，isoflurane group and isoflurane＋LDN193189 group were injected with special gas mixed with 2% isoflurane for 1 h，and isoflurane content was detected by anesthesia gas detector.Ensure isoflurane concentration was maintained at 2% at all times.After ventilation，rats in isoflurane＋LDN193189 group were intraperitoneally injected with BMP4/Smad pathway inhibitor solution of 20 μL（LDN193189，5 mg/kg），the positive drug group was intraperitoneally injected with 20 μL（10 mg/kg） of valsartan solution，and the healthy control group，model group and isoflurane group were intraperitoneally injected with the same volume of normal saline water.Oxygen tank ventilation test and injection were once a day for 10 days.The changes of tail artery systolic blood pressure were detected by non-invasive blood pressure detector.Neurological behavior score was used to evaluate behavioral function.Cerebral water content was used to measured the degree of cerebral edema.The histopathological changes and neuronal injury of hippocampus were detected by terminal deoxyribonucleotidyl transferase（TdT）-mediated dUTP nick end labeling（TUNEL） and Nysch staining.Fluorescence quantitative polymerase chain reaction（PCR） and Western Blot were used to detect the mRNA and protein expression levels of BMP4 and Smad2 mRNA and protein in hippocampus.Results：Compared with the model group，the apoptosis of hippocampal nerve cells in isoflurane group，positive drug group and isoflurane＋LDN193189 group decreased，the number of nissellite bodies increased，the blood pressure，neurological score，and cerebral tissue water content decreased significantly，and the mRNA and protein expressions of BMP4 and Smad2 increased significantly（P＜0.05）.Compared with the isoflurane group，the neuronal apoptosis of rats in isoflurane＋LDN193189 group increased，the nissellite bodies decreased sharply，the blood pressure，neurological score，and cerebral tissue water content significantly increased，and the mRNA and protein expressions of BMP4 and Smad2 significantly decreased（P＜0.05）.There was no significant difference between isoflurane group and positive drug group（P＞0.05）.Conclusion：Isoflurane can reduce SHR cerebral damage by promoting BMP4/Smad signaling pathway.

Keywordsspontaneous hypertension; brain damage; isoflurane; bone morphogenetic protein 4; Smad protein

高血压为我国常见的慢性疾病之一，随着人口老龄化的加剧，高血压疾病发生率逐渐增高，且由于饮食作息等因素，近年来高血压病人趋于年轻化［1-3］。目前，针对高血压疾病的治疗药物较多，且多为西药，尽管具有较好的疗效，但易出现一定的副作用［4-5］。高血压发病原因多样，受多条通路调控［6］。骨发生形态蛋白4（bone morphogenetic protein 4，BMP4）具有诱导骨形成的作用，不仅大量存在于骨组织中，在中枢神经系统中也高表达，调节神经元生长，在神经受损后加速神经细胞的生长与分化，从而缓解脑损伤，BMP4通常与其下游蛋白Smad结合，两者共同发挥作用［7-8］。异氟醚是一种具有乙醚样气味的特殊有机物，作为常见的吸入类麻醉药物，常用于手术的全身麻醉，具有良好的安全性［9-10］。研究发现，异氟醚对于脑缺血引起的脑损伤具有良好的治疗效果，已被应用于治疗缺血缺氧性脑损伤病人的神经损伤，对脑神经有良好的保护作用［11］。异氟醚可通过调控BMP4/Smad信号通路相关基因的表达缓解缺血再灌注损伤大鼠的脑损伤［12］。本研究以自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）为实验模型，探究异氟醚是否通过调控BMP4/Smad信号通路对SHR脑损伤产生影响。

1材料与方法

1.1主要试剂与仪器

异氟醚（货号080906）购于美国艾伯维公司，缬沙坦胶囊（国药准字H20040217，用生理盐水配成溶液）购于北京诺华制药有限公司，BMP4/Smad通路抑制剂（LDN193189，货号HY-12071）购于MedChemExpress公司，原位末端转移酶标记法（TUNEL）染色试剂盒（货号FA201-01）购于北京全式金生物技术有限公司，尼氏染色试剂盒（货号G1432）购于北京索莱宝科技有限公司，3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）抗体（货号ab9485）、BMP4抗体（货号ab124715）、Smad2抗体（货号ab280888）购于Abcam公司，羊抗兔二抗（货号7074S）购于Cell Signaling Technology公司。荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪（7500，ABI公司生产），小动物无创血压检测仪（panlab NIBP，深圳市瑞沃德生命科技有限公司生产），凝胶成像系统（HE-120，上海生工生物有限公司生产）。

1.2动物分组及干预

由河北省实验动物中心购得8周龄雄性Wistar SHR 48只、8周龄雄性健康Wistar大鼠12只，许可证号SCXK（冀）2018-004，体质量（250±35）g。通过神经学评分［13］评估大鼠行为功能，SHR评分均≥3分，健康大鼠评分均为0分，模型有效，其中，神经学评分0分为无抽搐反应，正常行走；1分为出现面部痉挛，伴肌痉挛；2分为间歇性抽搐；3分为伴剧烈强直性痉挛抽搐；4分为全身阵挛抽搐伴站立不稳；5分为难以站立，抽搐时间延长。采用随机数字表法将SHR分为模型组、异氟醚组、阳性药物组、异氟醚＋LDN193189组，健康大鼠作为健康对照组，每组12只。各组大鼠分别放入氧气箱中，健康对照组、模型组、阳性药物组大鼠通入特殊气体（30%O2、70%N2）1 h，异氟醚组、异氟醚＋LDN193189组通入混杂2%异氟醚的特殊气体1 h，通过麻醉气体检测仪检测异氟醚含量，确保异氟醚浓度始终保持在2%。通气结束后，异氟醚＋LDN193189组大鼠腹腔内注射BMP4/Smad通路抑制剂溶液20 μL（LDN193189，5 mg/kg），阳性药物组大鼠腹腔内注射缬沙坦溶液20 μL（10 mg/kg），健康对照组、模型组、异氟醚组大鼠腹腔内注射等量的生理盐水。氧气箱通气实验及注射每日1次，持续10 d。末次干预24 h后，通过神经学评分评估大鼠行为功能。

1.3大鼠血压监测

各组大鼠在首次氧气箱通气实验前及末次干预24 h后，用恒温水（40 ℃）持续冲洗大鼠尾部，使大鼠尾部松软并尾动脉扩张，毛巾擦干尾部后，在大鼠尾部套入小动物无创血压检测仪尾套，待血压测定仪界面出现稳定脉搏信号后，开始检测尾动脉收缩压，记录统计结果。

1.4大鼠脑组织含水量检测

末次检测血压后，处死各组大鼠，解剖获取大鼠脑组织，取出海马组织，部分组织置于4%多聚甲醛中固定备用，部分组织置液氮处理后研磨成粉，冻存备用。剩余脑组织称重，记作湿重，而后将脑组织放入烘干箱中，持续烘干24 h，确保烘干水分，而后取出称量，记作干重。通过脑组织含水量计算公式计算脑组织含水量＝（湿重－干重）/湿重×100%。

1.5TUNEL染色及尼氏染色检测神经损伤情况

取1.4中在多聚甲醛中固定24 h后的海马组织，不同浓度乙醇梯度脱水，二甲苯染色透明，石蜡包埋后切片（厚度5 μm），脱蜡至水，分别按照TUNEL染色试剂盒和尼氏染色试剂盒的制造商说明对切片进行处理，最后在光镜下观察染色结果并拍照。

1.6荧光定量PCR检测海马组织BMP4、Smad2 mRNA水平

取1.4中冻存备用的海马组织粉末，使用Trizol试剂提取海马组织总RNA，加入焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解，检测提取的RNA浓度，定量后反转录为cDNA。以cDNA为模板在荧光定量PCR仪上检测BMP4、Smad2 mRNA水平。以GAPDH为内参，采用2－△△Ct法计算BMP4、Smad2的相对表达水平。mRNA引物序列如下：GAPDH正向引物为5′-AGTTCAACGGCACAGTCAAG-3′，反向引物为5′-TACTCAGCACCAGCATCACC-3′；BMP4正向引物为5′-AGAAATGGTGCCTGGAC ACCTCAT-3′，反向引物为5′-TGGTCCCGGTTGTACAGTCCTAAT-3′；Smad2正向引物为5′-CCACTACCAGAGGGTGGAGA-3′，反向引物为5′-CCTGCTGGGAAATTTG TGTT-3′。

1.7蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测海马组织中BMP4、Smad2蛋白表达

取出剩余的海马组织粉末，加入蛋白裂解液充分震荡，溶解蛋白后加入蛋白提取液，再次震荡，静置片刻，4 ℃下10 000 r/min离心10 min，收集上层清液进行蛋白定量。将定量后的蛋白经电泳、转膜处理，然后用5%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗（GAPDH抗体、BMP4抗体、Smad2抗体，1∶1 000），4 ℃孵育过夜。倒出封闭液，用TBST缓冲液清洗3次，每次3 min。加入羊抗兔二抗（1∶1 500），常温孵育40 min，TBST清洗3次，每次3 min。将发光液混合后倒于膜上，避光染色1 min后吸净多余液体，置于光密度扫描系统进行条带灰度分析。

1.8统计学处理

采用SPSS 20.0软件进行数据分析。符合正态分布的定量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），进一步两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1异氟醚对SHR神经学评分及血压的影响

与健康对照组比较，模型组大鼠干预前后神经学评分及血压显著升高（P＜0.05）；与本组干预前比较，健康对照组、模型组大鼠干预后神经学评分及血压差异无统计学意义（P＞0.05），阳性药物组、异氟醚组、异氟醚＋LDN193189组干预后神经学评分及血压显著降低（P＜0.05）。与模型组干预后比较，阳性药物组、异氟醚组、异氟醚＋LDN193189组大鼠干预后神经学评分及血压显著降低（P＜0.05）；与异氟醚组干预后比较，异氟醚＋LDN193189组大鼠干预后神经学评分及血压显著升高（P＜0.05），干预前神经学评分及血压差异均无统计学意义（P＞0.05）；异氟醚组与阳性药物组比较，大鼠干预前后神经学评分及血压差异均无统计学意义（P＞0.05）。详见表1。

2.2异氟醚对SHR脑水肿的影响

与健康对照组比较，模型组大鼠脑组织含水量显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，阳性药物组、异氟醚组、异氟醚＋LDN193189组大鼠脑组织含水量显著降低（P＜0.05）；与异氟醚组比较，异氟醚＋LDN193189组大鼠脑组织含水量显著升高（P＜0.05）；异氟醚组与阳性药物组比较，大鼠脑组织含水量差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表2。

2.3异氟醚对SHR神经损伤的影响

TUNEL染色及尼氏染色显示，健康对照组大鼠海马组织中神经元细胞排列紧密，有大量均匀分布的蓝色颗粒状尼氏小体，未出现凋亡神经元。与健康对照组比较，模型组大鼠海马组织中神经元细胞排列松散，尼氏小体减少，观察到大量神经元细胞凋亡；与模型组比较，阳性药物组、异氟醚组大鼠海马组织中神经元细胞排列较为密集，尼氏小体逐渐增多，神经元细胞凋亡减少；与异氟醚组比较，异氟醚＋LDN193189组尼氏小体较少，神经细胞凋亡增多，且组织中神经元细胞排列分散。详见图1、图2。

2.4异氟醚对SHR海马组织BMP4、Smad2 mRNA表达的影响

与健康对照组比较，模型组大鼠海马组织BMP4、Smad2 mRNA表达显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，阳性药物组、异氟醚组、异氟醚＋LDN193189组大鼠海马组织BMP4、Smad2 mRNA表达显著升高（P＜0.05）；与异氟醚组比较，异氟醚＋LDN193189组大鼠海马组织BMP4、Smad2mRNA表达显著降低（P＜0.05）；阳性药物组与异氟醚组比较，大鼠海马组织BMP4、Smad2mRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表3。

2.5异氟醚对SHR海马组织BMP4、Smad2蛋白表达的影响

与健康对照组比较，模型组大鼠海马组织BMP4、Smad2蛋白表达量显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，阳性药物组、异氟醚组、异氟醚＋LDN193189组大鼠海马组织BMP4、Smad2蛋白表达量显著升高（P＜0.05）；与异氟醚组比较，异氟醚＋LDN193189组大鼠海马组织BMP4、Smad2蛋白表达量显著降低（P＜0.05）；阳性药物组与异氟醚组比较，大鼠海马组织BMP4、Smad2蛋白表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。详见图3、表4。

3讨论

高血压作为我国发病率较高的疾病，严重危害人类健康，长期的高血压会导致脑动脉粥样硬化，引起脑缺血，造成脑组织水肿及神经功能障碍［14-15］。异氟醚常作为麻醉用药用于临床试验，已证实可参与缓解脑损伤，且在临床应用，异氟醚预处理可帮助体外循环手术病人缓解脑损伤，改善认知功能［16］。同时对重度脑损伤病人脑部具有保护作用，可通过降低脑氧代谢率，缓解神经损伤［17］。异氟醚还可与其他通用麻醉类药物如丙泊酚等共同使用，麻醉同时缓解脑部损伤［18］。缬沙坦是治疗高血压及保护脑损伤的常用药物，故本研究选择缬沙坦作为阳性对照［19］。本研究结果显示，模型组大鼠神经学评分及血压显著升高，说明实验所用SHR确有高血压及高血压引起的脑组织损伤，异氟醚处理及阳性药物处理后，大鼠神经学评分及血压均显著降低，表明异氟醚具有与常规药物相同的治疗效果，可在降低高血压的同时，减轻脑损伤引起的行为功能障碍。

研究显示，海马组织作为中枢神经系统中重要的记忆组织，含有大量神经元，是判断脑损伤的重要组织；脑组织含水量是评判脑水肿的重要标志［20-21］。本研究结果显示，SHR海马组织尼氏小体大量减少，大量神经元细胞凋亡，脑组织含水量显著升高；阳性药物缬沙坦及异氟醚处理可增加尼氏小体数量，抑制神经元细胞凋亡，降低脑组织含水量，提示异氟醚可以缓解SHR海马组织神经元损伤，减轻脑水肿，维持脑组织结构正常，但具体的作用机制尚未明确。

研究显示，BMP4在中枢神经系统中发挥重要的保护作用，在脑缺血引起的脑损伤过程中参与保护神经细胞，从而缓解脑损伤带来的神经损害，BMP4与下游蛋白Smad结合，共同维护神经组织，缓解脑水肿等多种脑组织损害［22］。同时有研究指出，异氟醚可通过调控BMP4/Smad通路相关基因表达影响脑缺血再灌注损伤大鼠的症状［23］。故推测异氟醚可能通过调控BMP4/Smad信号通路参与对SHR脑损伤的保护作用。本研究结果显示，SHR海马组织中BMP4、Smad2 mRNA和蛋白表达显著降低，而异氟醚处理可提高大鼠海马组织BMP4、Smad2 mRNA和蛋白表达，说明BMP4/Smad信号通路参与SHR发生，而异氟醚很可能通过调控BMP4/Smad信号通路对SHR发挥作用。进一步研究显示，BMP4/Smad通路抑制剂可逆转异氟醚对SHR脑损伤的保护作用，再次验证了异氟醚通过促进BMP4/Smad信号通路参与缓解SHR脑损伤。

综上所述，异氟醚可通过促进BMP4/Smad信号通路降低SHR血压，并减轻大鼠脑神经元凋亡及脑水肿，缓解脑组织损伤，减轻大鼠行为功能障碍，从而治疗和改善高血压及其并发症。异氟醚治疗高血压具有较好的疗效，且安全易操作，有很大的应用空间，但异氟醚是否还通过调节其他通路间接参与调控高血压，仍有待进一步的实验验证。

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（收稿日期：2021-11-17）

（本文编辑邹丽）