基于生物信息学改造天然抗菌肽的研究

■ 宋雪莹 高圣玥 李 平 宋 岩 赵金波 李 莉 唐玲玲 李梦姝

（黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，黑龙江齐齐哈尔 160000）

抗生素的发现与使用有效解决了病原菌感染给畜牧生产带来的损失，也曾作为生长促进剂添加到饲料中，解决低日龄畜禽因免疫系统不完善而发病等问题[1]。但抗生素的长期大量使用，所引发的问题日益突出。病原菌耐药性的不断累积，导致超级细菌的出现，使得对抗生素的使用更为谨慎[2-4]。同时，畜禽体内会残留抗生素，转移到人体内，危害人类健康[5-6]。自2020 年起，我国畜禽饲料中已经停止使用促生长类抗生素（中药类除外）[7]。因此，开发新型安全、具有抗菌作用、可替代抗生素的饲料添加剂成为研究的热点。

抗菌肽（AMPs）由生物机体先天免疫系统产生，含6～50 个氨基酸，呈阳离子型，具有抗菌、抗病毒、抗寄生虫、抗肿瘤细胞等作用[8]。AMPs对病原菌不产生耐药性，在替代抗生素作用上具有重大潜力。天然AMPs 来源广泛，植物、细菌、原核生物、昆虫、哺乳动物均可产生[9-11]，AMPs 通过多种机制杀死细菌，包括膜破坏、干扰细菌代谢和靶向细胞质成分[12]。但天然抗菌肽氨基酸序列存在冗余区域、溶血和细胞毒活高、稳定性差等缺点[13]。基于生物信息学方法，可对天然AMPs进行改造，通过修饰、替换、截短、重头设计等方法获得活性高且稳定的新型抗菌肽。

1 生物信息学在线软件

利用生物信息学在线软件，可对改造前后AMPs的二级结构、三级结构、理化性质、稳定性、细胞毒性等进行科学地模拟和预测，确保改造后表达的抗菌肽具有较高抗病原体活性、稳定性和低毒性，既节约了科研时间又节约了成本。现阶段，常用的抗菌肽分子设计和预测在线分析工具见表1。将多肽的氨基酸序列或Fasta 格式输入在线软件中，选择相应参数可对其不同性质进行分析和预测。

表1 常用抗菌肽分子设计和预测在线分析工具

2 AMPs的改造内容

影响抗菌肽活性的主要因素包括肽链长度、净电荷、两亲性和二级结构等。抗菌肽的改造包括肽链适宜的长度、净电荷数、亲水性和疏水性，结构简单，对蛋白酶稳定等，可以提高AMPs的活性。

2.1 AMPs的肽链长度

在一定范围内，抗菌肽肽链长度的增加可提高抗菌活性，但过长也会增强对动物机体产生毒副作用[14]。Erbani等[15]筛选CecropinA-Magenin2杂交肽及其截短衍生肽的抗真菌特性，即CMT1、CMT2 和CMT3，分别为10、8、6 个氨基酸残基，虽具有相同疏水性，但随着分子大小的降低，活性逐渐降低，其中含有10 个氨基酸残基的CMT1抗真菌能力较强，毒性较小。

2.2 AMPs的净电荷

净电荷指抗菌肽肽链中氨基酸所带正、负电荷的总和。病原菌细胞膜的磷脂酰肌醇呈负电性，抗菌肽在静电作用下与其结合，使细胞膜去极化，形成通道或孔，从而导致细胞膜功能障碍和细胞死亡[16]。由于哺乳动物细胞膜呈中性，富含磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱和鞘磷脂等两性分子，使得抗菌肽不与动物体细胞发生作用，避免了对机体自身的损伤[17]。因此，增加带正电荷的氨基酸的数量或改变它们在肽链中的位置会影响AMPs 的二级结构，从而进一步影响其抗菌活性[18]。

为研究净电荷对膜活性肽生物活性的影响，Katrina 等[19]以抗菌肽P（A12L/A20L）为模板，通过氨基酸替代的方法，设计含有不同电荷的多肽序列，采用Fmoc 固相法合成多肽；经抗癌症细胞试验表明，改造后抗癌多肽随着净电荷的增加抗菌活性增强，当多肽所带净电荷过高时，二级构型发生变化，稳定性降低，结果表明，抗癌多肽净电荷的最适的范围为+7～+8。

2.3 AMPs的两亲性

抗菌肽的两亲性包括亲水性和疏水性，基于抗菌肽两亲性，与病原体质膜间发挥作用的模型有以下几种：桶板模型[20]、螺旋孔模型[21]、地毯式模型[22]、聚集模型[23]等4 种模型。桶板模型是AMPs 亲水基团插入病原体细胞膜内侧，疏水基团在细胞膜外侧，形成桶板结构，破坏膜完整性。螺旋孔模型是AMPs 与病原体细胞膜疏水基接触，取代极性头部，形成缺口，导致细胞膜变薄。地毯式模型类似于桶板机理，AMPs 肽链中疏水基团与病原体细胞膜中磷脂膜相向，亲水基团在质膜外，聚集在膜表面，导致细胞膜丧失功能。聚集模型是AMPs 在细菌细胞膜表面，与膜表面脂质双分子层形成复合物，导致细胞膜弯曲，抗菌肽进入膜内部，细菌破裂死亡。对AMPs 两亲性发挥活性机理的研究发现，其疏水性越强，抗菌活性越强[24]；但随着疏水性的增强，肽的毒性增强，表现为溶血性增强[25]。色氨酸（Try）、芳香氨基酸替换可增强肽的疏水性，促进多肽与膜的相互作用。

为进一步证明抗菌肽两亲性对活性的影响，将天然抗菌肽Leucocin A，经精氨酸（Arg）和亮氨酸（Leu）替代原始肽中带负电荷氨基酸和不带电荷亲水氨基酸，优化两亲性结构，从而筛选出抗菌活性较好的WRL7，再用亮氨酸（Leu）分别替代甘氨酸（Gly），获得3 条极性一侧均为正电荷氨基酸，非极性一侧均为疏水性氨基酸的衍生肽，抑菌试验结果表明，完整的两亲性结构抑菌效果更明显[26]。

2.4 AMPs的二级结构

抗菌肽的二级结构包括α-螺旋、β-折叠、环状结构和无规则延伸。在已发现的天然抗菌肽中，α-螺旋肽种类和数量最多，且具有广谱抗菌性。α-螺旋在序列排列上呈现周期性，易于提高肽两亲性来影响活性[27]。抗菌肽序列中氨基酸组成直接影响α-螺旋程度，其中，苯丙氨酸（Phe）不利于螺旋形成，色氨酸（Trp）对螺旋含量的影响不明显，缬氨酸（Val）的螺旋结构倾向大于Phe和Trp[28]。除此之外，氨基酸残基之间的接触也决定肽最终构象[29]。

β-折叠较α-螺旋结构具有更强稳定性，抗酶解能力更强[30]。环状结构可促使多肽亲水性和疏水性间的平衡，减少肽与红细胞膜脂质间作用，降低了溶血性。

3 AMPs的改造方法

以天然抗菌肽序列为基础，通过氨基酸替代，不同肽间杂合，去除无活性氨基酸残基缩短肽链长度等方法，可获得新型抗菌肽，以提高多肽活性和安全性。

3.1 AMPs氨基酸残基替代

牛血红蛋白最早从牛血液中分离获得，具有抗菌活性，但稳定性较差。邓丽等[31]以抗菌肽数据库内牛血红蛋白β亚基氨基酸的序列为基础，筛选活性区域，获得1 条多肽YKK-18（KKVLDSFSNGMKHLDDLK），将其作为模板，采用氨基酸替换方法，设计了3条改 造 多 肽LJ-1（RRVLRSFSKGMKWLDRLL）、LJ-2（RRVLRILKHHQGLIRNLL）和DLK-3（KKVLRSFRRLMKRLSRLL），根据生物信息软件预测，均为带正电荷的亲水性多肽，呈α-螺旋结构。经最小抑菌浓度试验，而改造多肽对测试的大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓假单胞菌、葡萄球菌、白色念珠菌等均有不同程度的抗菌活性，对革兰氏阴性菌（大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓假单胞菌）、革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）、真菌（白色念珠菌）表现出优于模板肽的活性。同时，理化稳定性试验表明，改造肽LJ-1和LJ-2在高温、高酸碱性和高离子浓度条件下，仍表现出较好抗菌活性。因此，利用氨基酸替代方法，可获得活性更好、稳定性更强的新型抗菌肽。

以林蛙抗菌肽Chensirin 和家蝇抗菌肽CecMd 的杂交肽CC34（GWLKKIGKKIERVGQHTRDAILPILSLI GGLLGK）的氨基酸序列为模板，采用氨基酸替换的方式对序列进行改造，得到CC34PA（GWLKKIGKKIPRVGQHTRAAILPILSLIGGLLGK）、CC34PL（GWLKKIGKKIPRVGQHTRLAILPILSLIGGLLGK）、CC34K11（GWLKKIGKKIKRVGQHTRDAILPILSLIGGLLGK）、CC34P11（GWLKKIGKKIPRVGQHTRDAILPILSLIGGLLGK）4 种改造肽。经生物信息工具分析，改造肽提高了肽链的两亲性。抑菌试验表明，4 种改造肽对革兰氏阳性菌和阴性菌均有较强抑制作用[32]。

史霖等[33]对人源抗菌肽LL-37 的多个氨基酸进行了替换，获得衍生抗菌肽GLL-37，测定其抗菌活性和抗蛋白酶解能力，结果表明GLL-37 较LL-37 抗弹性蛋白酶的水解能力更强，且在高盐离子浓度下，GLL-37 也较LL-37 具有更强的抗菌活性。刘志新等[34]根据抗菌肽PMAP-23 的作用机理和氨基酸组成，将PMAP-23 N 端α-螺旋亲水面第5 位亮氨酸改为带有正电荷的精氨酸，重新设计合成新型抗菌肽PMAP-23LR，体外抑菌试验结果显示，PMAP-23LR对金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌、禽巴氏杆菌、产肠毒素性大肠杆菌的抑菌活性增强；稳定性试验结果显示，PMAP-23LR具有更强的耐酸碱性和热稳定性。

由此可见，通过氨基酸替换的方式，改变模板肽的两亲性、电荷数、二级结构，进而提高改造肽的抗菌活性和稳定性。

3.2 AMPs杂合

将两种或两种以上不同来源的抗菌肽保守序列，通过分子改造，合成一条肽链，从而提高多肽广谱性和活性。根据天蚕素和死亡素氨基酸序列，设计了含有天蚕素N 端1～7 个氨基酸残基和死亡素N-末端4～19 个氨基酸残基组成的杂交肽CA（1～7）-t（4～19），抑菌试验结果表明，杂合肽对常见的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有较强的抗菌活性[35]。

以抗菌肽Cec4 为母肽，将其与家蝇Cecropin 肽、蜂毒素、死亡素肽和蛙皮肽成熟肽序列杂合，经氨基酸序列比对，理化性质分析，三级结构预测，设计抗菌能力更强的6 条杂合肽。抑菌试验表明，杂合肽Cec4-2-1对大肠杆菌抑菌效果优于母肽，6条杂合肽对人红细胞均无溶血性[36]。另有研究，蜂毒素（Melittin）是呈碱性阳离子的多肽，具有较强的抑菌活性和高溶血性。人体防御素（HNP）不具有溶血活性，是人先天免疫系统抵御病原入侵时产生多肽，在中性粒细胞中被发现。利用生物信息方法预测和分析，将蜂毒素C端的15个氨基酸与人体防御素（HNP-1）作为母体肽杂合，设计杂合肽Me-HNP1，并在毕赤酵母中表达，抑菌试验表明，杂合肽对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑菌效果均优于母肽，同时降低了溶血性[37]。张宏刚等[38]将蜂毒素（Melittin）与贻贝素B（Mytilin-B）的核心功能序列杂合，利用SOE方法获得杂合抗菌肽Mel-MytB，抗菌结果表明，该杂合肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肠道沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、枯草芽孢杆菌均表现出抑菌活性。

由此可见，将不同来源抗菌肽的活性区域杂合，获得杂合抗菌肽，提高了抑菌活性，降低了溶血性。

3.3 AMPs重新设计

以抗菌肽数据库为模板，重头设计全新抗菌肽，经数据库比对，确认无相似性的改造抗菌肽。目前，重新设计抗菌肽在人类抗肿瘤细胞研究较多。利用抗菌肽对抗肿瘤细胞靶标机理，可重新设计抗菌肽。

据研究，根据天然宿主防御肽构效关系，以天然LFcin为模板，重新设计获得由5个阳离子残基、2～3个色氨酸（Trp）残基和1～2 亲脂性非天然氨基酸残基组成抗菌肽LTX-315。该肽对耐药和药物敏感的癌细胞都非常有效，而对正常细胞表现出较低的活性，有效避免了对机体正常细胞的毒副作用[39]。

Sylvie 等[40]研究发现，以阳离子两亲性基序为基础设计多肽，通过改变赖氨酸（Lys）和亮氨酸（Leu）的数量制备了4～10 个残基的环肽；引入谷氨酸（Glu）促进了环状结构的固相合成。测定对植物病原菌抑菌活性，结果表明，环化结构显著提高了多肽序列的抗菌活性，且具有偶数个残基的多肽具有较高的抗菌活性。张卫民等[41]研究以天然抗菌肽为模板重新设计获得基因工程抗菌肽对肿瘤细胞的作用，结果表明基因工程抗菌肽较天然抗菌肽对肿瘤细胞的作用强，而对正常细胞无杀伤作用，为利用基因工程抗菌肽治疗肿瘤疾病提供了新选择，同时克服提取天然抗菌肽活性低且成本高的缺点。

4 小结与展望

抗菌肽在抗菌、抗病毒、抗寄生虫、抗肿瘤细胞方面，表现出显著效果，且特殊的抗菌途径对动物机体不造成损伤，不产生耐药性。因此，在食品生物防腐剂、畜牧养殖、人体抗肿瘤疾病等领域已开展了研究。随着生物信息学技术的不断发展，天然抗菌肽改造更准确、更便捷。天然抗菌肽分子改造，具有以下几点优势：①提高抗菌肽的活性。天然抗菌肽序列存在冗余结构区域，不但影响活性且易产生毒副作用。通过分子改造方法，可改变其肽链长度和空间结构。②有针对性地结合病原体，有效治疗疾病。在人类抗肿瘤疾病的研究中，抗菌肽可作为靶向药物，直接作用于病原体。③提高表达量，为畜禽生产广泛应用提供途径。利用基因工程手段，将分子改造后肽的碱基序列克隆到表达菌株中，可大量获取目的抗菌肽。解决化学合成产量低，成本高的问题。由此可见，基于生物信息学技术，改造天然抗菌肽将成为发现更多活性强、毒性低、稳定性好新型抗菌肽的有效手段。