长链非编码RNA-NRON对小鼠心肌梗死后细胞凋亡的作用机制研究

高涵，张春晶，李淑艳，师岩，郭红艳，杨超

（齐齐哈尔医学院医学技术学院生物化学教研室，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是一种高发病率、高致死率的心血管疾病［1］。大量心肌细胞因缺血缺氧导致凋亡而丢失，是引起MI后心肌重构、心力衰竭及死亡的根本原因［2-3］。因此，抑制心肌细胞凋亡是治疗MI的重要策略。

电压依赖性阴离子通道蛋白（voltage dependent anion channel，VDAC）是位于线粒体外膜上的通道蛋白，可通过多种机制影响细胞凋亡进程［4］。VDAC的表达异常可导致多种疾病的发生，如癌症、阿尔茨海默病等［5］。长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）广泛参与细胞凋亡、信号传导、增殖、分化等重要生物学进程，在心血管疾病的发生发展中具有重要意义［6-7］。lncRNA-NRON是活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）的非编码RNA抑制物［8］。研究表明，lncRNA-NRON可通过抑制由心房肌细胞激活的M1巨噬细胞减轻心房纤维化［9］，在心力衰竭患者血浆中高表达［10］，还可促进小鼠心肌肥厚的发生发展［11］，但其在MI中的作用尚不明确。本研究拟通过构建MI小鼠动物模型，检测lncRNA-NRON对小鼠MI后细胞凋亡的影响及其与VDAC的调控关系，旨在为MI机制的研究和治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

1.1.1 实验动物及MI模型建立：C57BL/6成年雄性小鼠40只，体质量20～25 g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供。小鼠适应性饲养1周，腹腔麻醉（阿弗汀0.2 g/kg）后固定，气管插管连呼吸机。在小鼠头部向下第2和第3肋骨间打开胸腔，暴露心脏，用7-0结扎线结扎左心耳下方1～2 mm处（冠状动脉左前降支位置）心室肌。观察心电图出现ST段抬高，则表明结扎位置正确，MI模型建立成功。本研究获得齐齐哈尔医学院实验动物伦理委员会批准，所有操作均按照相关指南执行。

1.1.2 分组和预处理：将40只小鼠随机分成假手术（Sham）组、MI组、MI+注入lncRNA-NRON干扰慢病毒（MI+shNRON）组、MI+注入阴性对照慢病毒（MI+NC）组4组，每组10只。Sham组仅开胸不结扎，MI组仅制备MI模型，MI+shNRON组/MI+NC组先给予小鼠心室壁点注射敲减lncRNA-NRON慢病毒/阴性对照慢病毒后，再制备MI模型。所有小鼠标准饲养7 d后麻醉处死，取出心脏，切取左心室MI边缘区缺血组织，置于-80℃冻存。

1.2 方法

1.2.1 HE染色：用生理盐水冲洗心脏，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片（厚5 μm），HE染色。在光学显微镜下观察心肌组织病理损伤变化。

1.2.2 TTC染色：迅速取出心脏，洗净后于-80℃冷冻10 min，取出后自心尖向结扎线方向切成5片，浸入2%TTC溶液，37℃孵育15 min，梗死区染为白色，非梗死区染为深红色。用Image J软件计算梗死百分比（%）=梗死区面积/（梗死区面积+非梗死区面积）×100。1.2.3 TUNEL染色：将心肌组织冰冻切片置于4%多聚甲醛中固定，PBS漂洗3次后，用0.1%Triton X-100穿透组织，按照TUNEL试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）说明书染色，用DAPI染细胞核，置于荧光显微镜下观察及拍摄。计算凋亡率（%）=凋亡细胞数/总细胞数×100。

1.2.4 实时PCR检测lncRNA-NRON表达水平：TRIzol法提取心肌组织总RNA，按照试剂盒（日本TOYOBO公司）说明书逆转录cDNA，采用SYBR Green法进行实时定量PCR检测。β-actin做内参照。引物序列见表1。

表1 实时定量PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for real-time PCR

1.2.5 RPIseq数据库预测lncRNA-NRON与VDAC之间的相互作用关系：RPIseq（http：//pridb.gdcb.iastate.edu/RPISeq/）数据库［12-13］是一个根据RNA和蛋白质的序列，采用随机森林和支持向量机2种算法对RNA和蛋白质的相互作用进行预测的软件。计算结果为2种算法得出的互作概率，＞0.5为阳性结果，即二者可能存在相互作用关系。

1.2.6 Western blotting：取适量心肌组织，用手术剪剪碎，加入RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，SDS-PAGE电泳分离蛋白，转膜，封闭，孵育（caspase-3、Bax、Bcl-2、VDAC、β-actin）一抗、二抗，ECL显色，应用Image J软件分析蛋白条带灰度值。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism 7.0软件进行统计学分析。计量资料用±s表示，2组比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MI小鼠模型建立成功

采用冠状动脉左前降支结扎法构建小鼠MI模型，观察心电图，与Sham组相比，MI组ST段抬高呈弓背向上型，表明MI小鼠模型建立成功。见图1。

图1 MI小鼠建模后心电图ST段抬高Fig.1 ECG showed ST segment elevation after myocardial infarction

2.2 各组lncRNA-NRON表达水平

构建lncRNA-NRON慢病毒干扰载体，采用主动脉夹闭法将病毒载体注入小鼠左心室腔内，同时结扎冠状动脉左前降支。1周后，实时PCR检测各组小鼠心肌组织中lncRNA-NRON表达水平。结果显示，与Sham组（1.00±0.10）相比，MI组（2.66±1.06）lncRNA-NRON表达显著升高；与MI组相比，MI+shNRON组（1.15±0.45）lncRNA-NRON表达下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。MI+NC组（2.57±0.31）与MI组比较，差异无统计学意义。

2.3 各组小鼠心肌组织病理损伤情况

HE染色检测各组小鼠心肌组织病理学改变情况，结果显示，Sham组心肌细胞排列整齐，结构清晰，MI组心肌炎症细胞浸润明显，间质充血严重，MI+shNRON组心肌组织病理损伤较MI组明显减轻，MI+NC组与MI组相比则无明显改善。见图2。

图2 HE染色检测各组心肌组织病理损伤 ×200Fig.2 HE staining was used to examine pathological changes in myocardial tissue ×200

2.4 各组小鼠MI面积比较

TTC染色检测各组心肌的梗死百分比，结果显示，MI组梗死百分比［（34.62±1.82）%］较Sham组［（0±0）%］显著升高，与MI组相比，MI+shNRON组梗死百分比［（24.50±2.24）%］显著下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。MI+NC组［（33.73±2.34）%］与MI组比较无显著差异。

2.5 各组小鼠心肌细胞凋亡情况

TUNEL实验检测各组心肌细胞凋亡情况，结果显示，与Sham组相比，MI组可明显检测到凋亡信号，与MI组相比，MI+shNRON组凋亡信号下降，MI+NC组则无明显变化（图3）。进一步计算凋亡率显示，MI组凋亡率［（35.12±3.86）%］高于Sham组［（2.12±1.23）%］，MI+shNRON组凋亡率［（19.34±3.15）%］低于MI组，差异均有统计学意义（P＜0.05），而MI+NC组凋亡率［（31.92±3.44）%］与MI组相比，无统计学差异。

图3 TUNEL染色检测各组心肌细胞凋亡情况×200Fig.3 Apoptosis of myocardial cells in each group was detected with TUNEL ×200

2.6 各组小鼠心肌组织凋亡相关蛋白表达情况

Western blotting结果显示，与Sham组相比，MI组促凋亡因子caspase-3（1.69±0.37）、Bax（1.92±0.41）蛋白表达水平升高，抑制凋亡因子Bcl-2（0.61±0.11）蛋白表达水平下降；与MI组相比，MI+shNRON组caspase-3（1.13±0.04）、Bax（1.28±0.12）蛋白表达水平下降，Bcl-2（1.00±0.13）蛋白表达水平升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。MI+NC组caspase-3（1.60±0.16）、Bax（1.95±0.21）及Bcl-2（0.61±0.15）蛋白表达水平与MI组比较无统计学差异。见图4。

1，Sham group；2，MI group；3，MI+shNRON group；4，MI+NC group.图4 Western blotting检测各组凋亡相关蛋白表达情况Fig.4 The expression of apoptosis-related proteins in each group was detected with Western blotting

2.7 lncRNA-NRON调控VDAC表达水平

用RPIseq数据库预测lncRNA-NRON与VDAC之间的相互作用，结果显示，根据支持向量机算法获得互作概率为0.96，表明lncRNA-NRON与VDAC之间有非常大可能性存在互作关系。进一步在MI模型中检测敲减lncRNA-NRON对VDAC表达的影响，结果表明，与Sham组（1.00±0.00）相比，MI组VDAC蛋白表达（1.67±0.19）显著升高，MI+shNRON组VDAC蛋白表达水平（1.10±0.05）较MI组显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。MI+NC组（1.61±0.11）与MI组比较无统计学差异。提示lncRNA-NRON可调控VDAC蛋白的表达。见图5。

图5 敲减lncRNA-NRON对MI小鼠心肌组织中VDAC蛋白表达的影响Fig.5 Effects of lncRNA-NRON knockdown on the expression of VDAC in myocardium of MI mice

3 讨论

MI发病急，进展快，致死率高，可并发心律失常、心力衰竭等。研究表明，lncRNA可通过调控细胞凋亡、增殖、自噬等多种进程参与MI发生。如lncRNA-CAIF通过靶向抑制P53，干扰心肌蛋白转录，从而抑制自噬、缓解MI［14］。NFAT是细胞内重要的转录因子，参与癌症、心血管疾病、糖尿病等多种疾病的发生［15］。lncRNA-NRON是NFAT的非编码阻遏物，可作为RNA-蛋白复合物的细胞质支架，调节NFAT在T细胞中的定位和活性［16］。目前关于lncRNA-NRON的研究多集中于癌症，如XIONG等［17］发现，lncRNA-NRON在膀胱癌组织和细胞中显著高表达，敲低lncRNA-NRON可抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移、侵袭和成瘤能力。GUO等［18］研究发现，lncRNA-NRON通过增强E3连接酶MDM2对肿瘤抑制底物的活性促进肿瘤发生，且与乳腺癌患者的不良预后显著相关。lncRNA-NRON还可抑制上皮细胞向间质细胞转化过程，从而影响肝癌细胞的生长和转移［19］。lncRNA-NRON在心脏疾病中的研究相对较少，XUAN等［10］检测了72例心力衰竭患者和60例非心力衰竭对照者血浆中13个与心血管相关的lncRNA的表达水平，发现lncRNA-NRON在心力衰竭患者的血浆样本中呈显著高表达，可能成为预测心力衰竭的新型生物标志物。HOEPFNER等［11］最新发现，心肌细胞特异性过表达lncRNA-NRON可促进主动脉缩窄诱导的心肌肥大，而心肌细胞特异性敲除lncRNA-NRON则显示出抗心肌肥大的作用。

本研究首次探讨了lncRNA-NRON在MI中的作用及其对细胞凋亡的影响。首先成功构建了MI小鼠模型，检测发现lncRNA-NRON在MI小鼠心肌组织中表达显著升高。然后，构建敲减lncRNA-NRON慢病毒，注入小鼠心室肌后再构建MI模型，检测发现lncRNA-NRON的表达与MI组相比显著下降，证实敲减lncRNA-NRON成功。HE染色结果显示，敲减lncRNA-NRON可明显改善心肌组织病理损伤，减少炎症细胞浸润。TTC染色表明，敲减lncRNA-NRON可有效减少MI小鼠梗死面积。以上均提示敲减lncRNA-NRON可改善MI小鼠心肌损伤，发挥心肌保护作用。MI后心肌细胞缺血缺氧发生细胞凋亡，可进一步加剧心肌损伤，因此抑制细胞凋亡是改善MI的重要策略，本研究中，TUNEL及Western blotting结果均证实敲减lncRNA-NRON后可显著降低心肌细胞凋亡率，抑制凋亡相关基因caspase-3及Bax的表达，表明敲减lncRNA-NRON可有效抑制MI后细胞凋亡的发生，减轻心肌损伤。VDAC是线粒体外膜上分子或离子交换的出入通道，VDAC通道开放可促进钙离子内流，线粒体肿胀、通透性增加，启动细胞凋亡进程。研究［20］显示，VDAC表达上调在缺血性心肌病中发挥重要作用，VDAC过表达可通过激活线粒体凋亡加重心肌损伤，抑制丹参酮对缺氧心肌的保护作用。敲低VDAC可增强miR-7a-5p对缺氧/复氧诱导的细胞损伤的保护作用［21］。本研究首次探讨了lncRNA-NRON对VDAC的调控作用，通过RPIseq数据库预测出lncRNA-NRON与VDAC之间的互作概率高达0.96，进一步检测发现，VDAC在小鼠MI模型中的表达显著升高，而敲减lncRNA-NRON后可有效逆转这一现象，以上结果表明lncRNA-NRON可能是通过与VDAC结合并下调其表达抑制细胞凋亡的发生，从而发挥心肌保护作用。

综上所述，本研究首次发现lncRNA-NRON在小鼠MI模型心肌中表达显著上调，敲减lncRNA-NRON可减轻心肌组织病理损伤，减小MI面积，抑制MI后细胞凋亡，发挥心肌保护作用。其具体机制可能是lncRNA-NRON通过与VDAC结合并抑制其表达，影响细胞凋亡进程相关。本研究为预防和治疗MI后心力衰竭提供了新的证据。