二氢青蒿素结合SERCA2b诱导结肠癌HCT-116细胞凋亡的机制研究
2024-04-29孙卢浩然卢敏
孙卢浩然,卢敏
(中国医科大学附属第一医院 1.泌尿外科;2.肛肠外科,沈阳 110001)
结肠癌是一种常见的恶性肿瘤,死亡率较高[1-2]。常规化疗药物耐药是结肠癌预后差的重要原因[3-4]。二氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)对多种恶性肿瘤具有抗肿瘤作用[5-8]。前期研究[9]证实,DHA可通过内质网凋亡途径诱导结肠癌HCT-116细胞凋亡,肌浆/内质网钙 ATP 酶(sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase,SERCA)2b活性下降,但其具体机制尚不明确。SERCA在维持Ca2+稳态中起关键作用,并可通过下游多个通路诱导细胞凋亡,其抑制与否对细胞的生死决策有重要的影响[10]。多种天然药物提取物抗癌作用的靶点也被证实为SERCA,如金丝桃素[11]、姜黄素[12]等。DHA亦可调控细胞内质网和细胞质Ca2+失衡,引起内质网应激反应诱导细胞凋亡[13-14],因此,DHA可能也是通过作用于SERCA,诱导结肠癌细胞凋亡,具体机制有待阐明。本研究首次采用LeDock分子对接方法及生物膜干涉技术,预测并证实DHA与SERCA2b的结合及其结合位点,揭示了DHA通过线粒体途径诱导结肠癌HCT-116细胞凋亡。
1 材料与方法
1.1 细胞及处理
人结肠癌细胞HCT-116购自中国科学院上海细胞库。用含10%胎牛血清(美国Hyclone公司)、1%青链霉素的McCoy’s 5A培养基(美国Gibco公司),在37℃、5%CO2培养箱中培养。常规换液、传代。当细胞生长至80%~90%,分别加入不同浓度(10、20、40 μmol/L)DHA处理,并设置DMSO处理的对照组。
1.2 方法
1.2.1 SERCA活性检测:通过差速离心提取微粒体蛋白质。用BCA试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)测定蛋白浓度,根据SERCA活性检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书检测SERCA活性,1 h后酶标仪读取600 nm光密度值。每个点重复检测3次。SERCA活性以每毫克微粒体蛋白每小时产生无机磷酸盐的量表示。
1.2.2 Western blotting检测:通过细胞裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)裂解提取总蛋白,BCA试剂盒检测蛋白浓度,上等量蛋白样品行SDSPAGE凝胶电泳,电转移至PVDF膜(美国Millipore公司)。室温条件下,用5%脱脂牛奶封闭PVDF膜1 h,加入小鼠SERCA2单克隆抗体(sc-376235,美国Santa Cruz Biotechnology公司)4℃孵育过夜。洗膜后,用二抗辣根过氧化物酶标记的抗鼠IgG抗体37℃孵育45 min。采用ECL试剂盒(美国Millipore公司)显像。β-actin和COX-Ⅳ作内参照。
1.2.3 流式细胞仪检测:按照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司)说明书检测。分别将HCT-116细胞培养于含0、10、20、40 μmol/L DHA的培养基中24 h。用胰酶消化细胞,待细胞变圆脱落后,加入完全培养基终止消化,PBS洗涤2次,并进行细胞计数。加入500 μL Binding buffer重悬细胞,加入5 μL Annexin V-FITC、10 μL PI混匀,室温避光反应15 min。行流式细胞仪检测,通过FL1检测Annexin V-FITC,FL2检测PI。
1.2.4 细胞增殖检测:用CCK-8检测试剂盒分析细胞增殖情况。将细胞按2×104/孔接种至96孔板中,分别用不同浓度DHA(10、20、40 μmol/L)处理。每孔加入 CCK-8试剂10 μL,37℃孵育1 h。用酶标仪检测450 nm处吸光度值。
1.2.5 Hoechst核染色:将细胞接种至12孔板,待生长至亚融合状态后,用10、20、40 μmol/L DHA处理,37℃培养24 h后,用Hoechst33342染色,荧光显微镜下观测细胞凋亡。
1.2.6 线粒体膜电位检测:在0~6 h时分别用40 μmol/L DHA处理HCT-116细胞,然后用1 mg/mL JC-1探针(江苏凯基生物技术股份有限公司)37℃避光孵育15 min。细胞洗涤后,通过IX73显微镜观察。通过流式细胞仪在530 nm(FL1通道)和590 nm(FL2通道)检测荧光强度,通过红色荧光(FL2通道)与绿色荧光(FL1通道)的比值计算线粒体膜电位(ΔΨ)。
1.2.7 DHA与SERCA2b相互作用位点的预测:根据PDB数据库(https://www.rcsb.org/)信息,蛋白质SERCA2b的PDB ID为6LN6。使用LeDock软件(http://www.lephar.com/index.htm)进行互作位点预测。每个结合位点生成100个构象,以RMSD=1.0 Å进行聚类,其他参数默认设置。对接结果选择结合能最低的构象,然后选择结合能最低的构象,用PLIP和PyMOL进行结合位点的分析。
1.2.8 SERCA2b(314-756aa)野生型及突变体的重组蛋白表达:为了达到位点研究的目的,对预测的位点进行突变,将SERCA2b(314-756aa)突变体的氨基酸Ile315和Thr316突变为对蛋白功能及结构影响较小的丙氨酸[8]。为成功表达SERCA2b(314-756aa)野生型及突变体蛋白,利用基因合成技术合成了SERCA2b(314-756aa)野生型及突变体基因,插入his标签,将2段基因分别连接到pET30a表达载体。利用大肠杆菌表达体系对2种蛋白分别进行表达。表达成功后,利用镍柱对2种重组蛋白进行纯化。对纯化后的蛋白进行复性,并进行SDS-PAGE检测,确定其浓度和纯度。
1.2.9 SERCA2b(314-756aa)野生型及突变体与DHA结合的检测:利用生物膜干涉技术分别检测SERCA2b(314-756aa)野生型及突变体与DHA之间的结合。拟合模型选择1∶1,即1个重组蛋白结合1个小分子DHA,拟合方式global,即把5个浓度作为1组关联进行分析。
1.3 统计学分析
采用Data Analysis software 9.0进行统计学分析,计量资料用±s表示,采用Student’st检验比较组间差异。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 DHA抑制SERCA活性的同时降低SERCA2蛋白的表达水平
用不同浓度DHA(0、10、20、40 μmol/L)处理HCT-116细胞24 h,结果显示,细胞中SERCA活性减弱(图1A);Western blotting结果显示,0、10、20 μmol/L DHA不影响SERCA2蛋白表达,而40 μmol/L DHA明显抑制了SERCA2蛋白表达(图1B)。提示高浓度DHA可影响HCT-116细胞中SERCA2蛋白的表达。
A,SERCA activity is determined by the amount of inorganic phosphate produced per hour per milligram of microsomal protein;B,Western blotting measured SERCA2 protein levels and quantified them by density values,β-actin as an internal reference,and the data were expressed as ±s deviation of three independent replicates.*P<0.05 vs.0 μmol·L-1 DHA.图1 DHA抑制HCT-116细胞SERCA活性及其蛋白表达水平Fig.1 DHA inhibits SERCA activity and reduces the expression of SERCA2 protein in HCT-116 cells
2.2 DHA通过抑制SERCA活性抑制HCT-116细胞增殖
CCK-8检测结果显示,DHA处理48~72 h后,HCT-116细胞增殖活性显著降低,并呈剂量相关性(P<0.01)(图2A)。Hoechst核染色显示,与对照组相比,DHA诱导HCT-116细胞膜通透性增加,细胞核变圆、固缩,染色质凝缩,即出现凋亡细胞特征(图2B)。
A,after exposed to progressively increasing concentrations(0,10,20,40 μmol/L)of DHA,HCT-116 cell viability was assessed using CCK-8.*P<0.01 vs.0 μmol/L DHA after 48 h treatment,**P<0.01 vs.0 μmol/L DHA after 72 h treatment;B,after co-incubating HCT116 cells with different concentrations of DHA for 24 h,Hoechst 33342 staining was performed and observed by fluorescence microscopy to detect apoptosis(×10).Arrows indicate apoptotic cells.图2 DHA诱导的抗增殖及促凋亡作用Fig.2 DHA-induced antiproliferative and pro-apoptosis effects
2.3 DHA诱导细胞线粒体膜电位降低
JC-1的单体形式发绿色荧光,而在膜极化的线粒体中形成聚合体(即线粒体膜电位增加),并发红色荧光。用DHA处理HCT-116细胞,随着时间推移,细胞内红色荧光消失(图3A),提示线粒体膜电位下降。流式细胞分析结果显示,在DHA处理的最初数小时内,线粒体膜电位稍下降,而在5 h后,超过半数细胞线粒体膜电位明显下降(图3B)。
A,fluorescence microscopy(×10);B,analysis of results,data expressed as ±s deviation of three independent replicates.*P<0.05,**P<0.01,compared with 0 h.图3 DHA诱导线粒体膜电位下降Fig.3 DHA-induced decrease in mitochondrial membrane potential
2.4 SERCA2b与DHA相互作用位点的预测
通过软件对最小结合能构象进行分析,发现DHA与SERCA2b的Arg246、Gln250、Thr316形成氢键相互作用,与Glu58、Asp59、Pro312和Ile315有疏水相互作用。预测DHA和SERCA之间的结合模式见图4。
图4 DHA和SERCA之间结合模式的预测Fig.4 Predicted binding patterns between dihydroartemisinin and SERCA
2.5 SERCA2b(314-756aa)野生型及突变体的重组蛋白表达
用最大的非跨膜相aa314-756对SERCA2b蛋白进行相互作用位点研究,结果显示,SERCA2b(314-756aa)包含了Thr316和Ile315这2个结合位点,因此,以Thr316和Ile315为预测结合位点进行突变研究。在SERCA2b(314-756aa)的突变体中,为了避免干扰蛋白质结构,将Thr316和Ile315突变成为丙氨酸(图5)。
M,marker;1,SERCA2b(314-756aa)wild-type protein recombinant protein;2,SERCA2b(314-756aa)mutant recombinant protein.图5 蛋白质质量表达纯化凝胶图Fig.5 Protein mass expression purification gel diagram
2.6 SERCA2b(314-756aa)野生型及突变体与DHA之间的结合检测结果
首先,检测SERCA2b(314-756aa)野生型与DHA之间的结合。结果如图6A所示,随着分析物浓度的增加,结果相应增加,即呈显著正相关,表明SERCA2b(314-756aa)野生型蛋白和小分子DHA之间存在相互作用。然后,检测了SERCA2b(314-756aa)突变体与DHA之间的结合。结果如图6B所示,随着分析物浓度的增加,结果未显示相关性,意味着SERCA2b(314-756aa)突变体蛋白和小分子DHA之间无相互作用。证明Thr316和Ile315有可能是SERCA2b(314-756aa)与小分子DHA之间相互结合的关键性氨基酸位点。
A,interaction between wild-type SERCA2b and dihydroartemisinin;B,interaction between mutant SERCA2b and dihydroartemisinin.图6 SERCA2b和DHA之间的相互作用Fig.6 Interaction between SERCA2b and dihydroartemisinin
3 讨论
DHA可抑制多种肿瘤细胞的增殖,促进细胞凋亡。研究[9]表明,DHA可抑制SERCA2b,导致肿瘤细胞内质网中Ca2+紊乱,从而通过内质网、线粒体、死亡受体等多种途径诱导细胞凋亡。
为探讨DHA在HCT-116细胞线粒体途径凋亡中的作用,本研究首先使用流式细胞仪检测DHA处理后HCT-116细胞的凋亡情况,并通过Western blotting检测SERCA2b蛋白的表达。结果发现,DHA抑制了SERCA2b活性并降低了SERCA2b蛋白的表达水平,促进了HCT-116细胞凋亡,且与浓度呈正相关。
为了阐明线粒体参与DHA诱导的结肠癌细胞凋亡机制,本研究检测了DHA处理后线粒体膜电位的变化,发现DHA作用细胞5 h时线粒体膜电位急剧下降。说明线粒体功能障碍是DHA诱导结肠癌细胞凋亡的机制之一。DHA诱导的线粒体膜电位降低发生在DHA暴露后相对较早的时期。本研究还发现线粒体功能紊乱在DHA促进HCT-116细胞的凋亡中起关键作用。线粒体通路是典型的细胞凋亡通路。线粒体膜电位丧失导致细胞色素c从线粒体内释放至细胞质中,激活caspase-8和caspase-9,进而激活细胞凋亡的执行者caspase-3[15]。前期研究[16]发现,DHA可能导致HCT-116细胞线粒体膜电位崩溃,释放细胞色素c,增加Bax/Bcl2比率,激活caspas-3、caspas-8和caspas-9,证明线粒体参与了DHA诱导的结肠癌细胞的凋亡。
SERCA包含3种亚型,通过水解ATP,将细胞质中Ca2+转移至内质网腔内[17]。结肠癌细胞调控Ca2+平衡的主要是SERCA2b。SERCA2b是一种多跨膜蛋白,很难在体外表达[6],这也限制了DHA与SERCA具体结合位点的研究。为进一步确定DHA调控SERCA2b活性的靶点,本研究选取SERCA2b最长的一段Topological domain(314-756aa),该段属于细胞质区域。首先,应用生物膜干涉技术[7]检测并确认了SERCA2b和DHA间的结合。其次,应用LeDock分子对接方法预测DHA与SERCA 的结合位点[8,12],发现处于314-756aa段的Ile315和Thr316是可能的结合位点。进一步对Ile315和Thr316进行丙氨酸位点突变并表达突变蛋白,再次通过Octet 平台基于生物膜干涉技术[9-11],对合成的Ile315与Thr316位点突变后的SERCA2b突变蛋白和非突变蛋白分别与小分子DHA进行结合检测,结果证实突变型SERCA2b与DHA之间无相互作用,提示DHA可与SERCA2b的Ile315和Thr316位点直接结合。
综上所述,本研究结果显示,DHA可直接结合SERCA2b的Ile315和Thr316位点,通过增加HCT-116细胞内Ca2+浓度,导致Ca2+紊乱,继而通过线粒体途径诱导细胞凋亡。未来将尝试合成SERCA2b全蛋白,并进一步明确SERCA2b与DHA的全部结合位点及其上下游调控机制,以期为DHA抗肿瘤研究提供新思路,开辟新途径。