电化学法制备碳点荧光探针测定氯霉素含量的研究

何芳,张颖,张运良,孙双姣

摘要：以葡萄糖作为碳源，通过电化学碳化的方法制备碳点（C-dots）并表征其形貌和光学性质。将C-dots作为荧光探针检测氯霉素的含量。研究表明，所制备的C-dots在紫外光的激发下发射蓝色荧光（激发/发射波长分别为345/450 nm），氯霉素对C-dots荧光有猝灭作用，且C-dots荧光猝灭效率与氯霉素浓度呈现良好的线性关系，线性范围为0.1～5.0 mmol/L，检测下限为0.016 mmol/L（信噪比S/N=3）。该方法制备的C-dots具有优异的荧光性能及光学稳定性，可灵敏、便捷地检测氯霉素含量。

关键词：电化学法；碳点；氯霉素检测；荧光探针；药物分析

中图分类号：R917                 文献标志码：A

Synthesis of fluorescent carbon dots by electrochemical method for chloramphenicol probe

HE Fang1， 2， ZHANG Ying1， 2， ZHANG Yunliang1， 2， SUN Shuangjiao1，2

（ 1. School of Pharmacy， Shaoyang University， Shaoyang 422000， China; 2. Hunan Engineering Research Center of Development and Utilization of Traditional Chinese Medicine in Southwest Hunan， Shaoyang 422000， China）

Abstract： Using glucose as carbon source， the C-dots were synthesized by electrochemical carbonization method and the morphology and optical properties of C-dots were characterized. The prepared C-dots were used as fluorescence probe to detect the chloramphenicol. The results show that the as-prepared C-dots emit blue fluorescence when excited by ultraviolet light （excitation/emission wavelength was 345/450 nm， respectively）. The chloramphenicol has quenching effect on the fluorescence intensity of C-dots and the quenching effect of chloramphenicol on the fluorescence intensity of C-dots vs the concentration display a good linear relationship， with a detection linear range of 0.1～5.0 mmol/L and a lower limit of detection of 0.016 mmol/L. The as-prepared C-Dots have excellent fluorescence property and optical stability， which can be used for the detection of chloramphenicol content sensitively and specifically.

Key words： electrochemical method; carbon dots; chloramphenicol detection; fluorescence probe; pharmaceutical analysis

碳點（C-dots）是一种由分散的类球状碳颗粒组成、尺寸极小（10 nm以下）的新型荧光纳米材料，也称碳量子点。与传统的金属量子点相比，C-dots不含重金属元素，主要含有碳元素以及表面功能基团中可能含有的氢、氧等非金属元素，故毒性较低，对环境友好，且制备成本低廉[1-2]。因此，C-dots被广泛研究并应用于药物分析、食品安全、环境监测、医学成像、催化剂制备、能源开发等诸多领域[3-6]。

氯霉素（CHL）滥用问题存在于畜牧养殖业、渔业等行业，通过各种渠道进入到人体内，极大地威胁人体的健康[7-8]。因此，氯霉素含量测定具有重要的意义。荧光检测法简便且便于控制，还具有成本低、效率高、原料易得等优点，弥补了传统方法的缺陷，是实现氯霉素含量检测的重要手段[9]。C-dots由于具有激发光谱宽且连续分布，而发射光谱窄而对称，颜色可调，光化学稳定性高，荧光寿命长等优越的特性，可作为一种理想的荧光探针用于氯霉素的检测[10-11]。本研究采用电化学碳化葡萄糖的方法制备紫外光激发下发射蓝色荧光的C-dots，这种功能化C-dots可作为荧光探针，其荧光强度随氯霉素的加入而减弱，诱发C-dots荧光猝灭，实现氯霉素的检测。旨在开发一种氯霉素荧光传感器，以实现氯霉素简便、快速、灵敏分析。

1材料与方法

1.1仪器及试剂

电化学工作站（CHI660E，上海辰华仪器有限公司）；荧光分光光度计（F97Pro，上海棱光技术有限公司）；透射电子显微镜（JEM-2100，日本日立公司）；铂电极（213型，上海越磁电子科技有限公司）。

氯霉素（纯度大于98%）、多巴胺、尿酸、抗坏血酸购置于合肥博美生物科技有限责任公司；葡萄糖、柠檬酸纳、磷酸二氢纳、磷酸氢二钠等购置于天津市永大化学试剂有限公司，试剂均为分析纯。所用的化学品均未经进一步纯化。实验用水均为去离子水。

1.2实验方法

1.2.1C-dots的制备

采用电化学的方法，以葡萄糖为碳源制备具有荧光性质的C-dots。参考文献[12-14]，具体合成方法如下：配制葡萄糖（3 mol/L）与柠檬酸钠（1 mol/L）的混合物水溶液，搅拌溶解至溶液透明。采用饱和甘汞电极为参比电极，2个铂片电极分别作为工作电极和对电极的三电极系统电化学碳化葡萄糖制备C-dots。2个铂片电极之间的距离约为1 cm，利用电化学恒电位技术，在工作电极上施加5 V电位，碳化约1 h，直到透明溶液变黄再变成棕色。所得产品溶液通过透析膜对超纯水透析约6 h纯化，50 ℃下干燥后得到C-dots粉末，将其分散在0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液（PBS）中，制得C-dots溶液。

1.2.2C-dots光学性质的表征

采用荧光分光光度计测定了制备C-dots的最大激发光谱和最大荧光发射光谱，并考察其荧光光学性质。改变激发波长，分别测量C-dots在不同波长紫外光的激发下的荧光发射光谱，考察其荧光发射峰的变化。将所制备的C-dots中加入到不同pH的0.1 mol/L的PBS中制备浓度相同的C-dots溶液，测定其在最大激发波长下（345 nm）的荧光发射光谱，考察其在不同pH溶液中的荧光稳定性。在C-dots溶液中加入不同浓度的NaCl，考察溶液离子浓度对C-dots荧光性质的影响。将所制备的C-dots溶液在不同时间的紫外光照射后，测量其荧光发射光谱，考察紫外光照射对C-dots荧光性质的影响。

1.2.3氯霉素的检测

室温下， 测量PBS溶液中C-dots在最大激发波长（345 nm）下的荧光发射光谱。加入不同浓度的氯霉素，制备含不同浓度氯霉素的C-dots溶液，测量其最大激发波长下（345 nm）的荧光发射光谱。以氯霉素的浓度为横坐标，以加入不同濃度氯霉素后C-dots的荧光强度猝灭效率为纵坐标，绘制氯霉素标准曲线，实现氯霉素检测。

2结果

2.1C-dots的制备及表征

采用透射电子显微镜（TEM）对所制备的C-dots进行了表征，见图1（a）。结果表明，所制备的C-dots具有良好的分散性，C-dots的尺寸主要在5.0～7.5 nm范围内分布。采用荧光分光光度计研究了C-dots的光学性能，见图1（b）。C-dots溶液具有较宽的吸收光谱，其最大激发波长为345 nm（曲线1），最大发射波长为450 nm（曲线2），在紫外光的激发下，所制备的C-dots发射荧光。另外，为了得到荧光性质稳定、荧光强度高的C-dots，对原料溶液中葡萄糖和柠檬酸钠的浓度比、电化学碳化时间、电化学碳化电位等因素进行了优化。结果表明，葡萄糖/柠檬酸钠的浓度之比为3∶1，碳化时间为1 h，碳化电位为5 V时制备C-dots的最佳。因此，实验均采用该条件下制备的C-dots。

C-dots在300～460 nm的不同波长的紫外光激发下呈现出与激发波长相关的荧光发射特性，随着激发波长增加，最大荧光发射波长增加，荧光发射峰发生红移，其相对应的荧光发射峰范围在413～524 nm之间，见图2。该行为可能与C-dots不同的尺寸分布有关[12， 15-16]。

2.2C-dots的光学稳定性

分别测定了C-dots在不同pH环境、离子浓度的PBS溶液中荧光强度，研究了C-dots的荧光稳定性。结果表明，C-dots在酸性及中性环境的PBS溶液中（pH为3.0～7.0）有较强的荧光，且稳定性好；但在碱性环境的PBS溶液中（pH>7.0），其荧光强度明显减弱，见图3（a）。其次，离子浓度对C-dots荧光稳定性几乎没有影响，即使PBS溶液中NaCl浓度高达1.0 mol/L，C-dots在450 nm处的荧光强度也没有明显的变化，见图3（b），说明合成的C-dots在高离子浓度溶液中仍能够稳定存在[12]。

另外，考察了紫外光照射对C-dots荧光性质的影响。在经过连续紫外光线（345 nm）照射1 h后，C-dots荧光强度仍保持在83%（图4），表明所制备的C-dots在紫外光线照射下的荧光性质较稳定[12]。

2.3氯霉素的检测及标准曲线绘制

2.3.1氯霉素对C-dots荧光强度的影响

首先测定了C-dots溶液的荧光强度，然后加入一定浓度的氯霉素溶液后，C-dots的荧光强度明显减弱，增大加入的氯霉素浓度，荧光强度减弱幅度更明显（图5）。说明氯霉素的加入引起了C-dots荧光猝灭，且氯霉素浓度越大，猝灭效应越明显，从而可以实现氯霉素检测。这种荧光强度下降现象可归因于氯霉素与功能化C-dots相互作用后引发能量共振转移而诱发C-dots荧光猝灭[17-18]。

2.3.2检测条件优化

为了提高氯霉素对C-dots的荧光猝灭效率，达到更好的检测效果，优化了检测溶液的pH、猝灭反应时间等实验条件。实验结果表明，当pH为7.0时，C-dots的荧光猝灭效率最高，见图6（a）。因此，使用pH=7.0的PBS溶液为检测溶液。考察了反应时间对C-dots荧光猝灭效率的影响，见图6（b），在加入氯霉素后30 s内，荧光迅速猝灭，并在此后保持相对稳定。这说明C-dots在氯霉素存在下荧光猝灭动力学很快，为了保证荧光猝灭响应充分，故反应时间取2 min。

2.3.3氯霉素标准曲线

在优化检测条件下，对加入不同浓度氯霉素（从上到下依次为0、0.1、0.3、0.5、1、2、3、4和5 mmol/L）的C-dots溶液的荧光强度进行了测定（检测溶液为pH 7.0，0.1 M的PBS缓冲液）。见图7（a），随着氯霉素浓度增加，C-dots在紫外光激发下（345 nm）的最大发射峰（450 nm）处的荧光强度峰值逐渐降低。图7（b）为C-dots荧光猝灭效率（I0—I）/I0相对于不同浓度氯霉素（0.1～5 mmol/L）的工作曲线，结果表明，C-dots荧光猝灭效率与氯霉素浓度呈现良好的线性关系，线性范围为0.1～5.0 mmol/L，检测限为0.016 mmol/L（信噪比为S/N=3）。

2.3.4抗干扰实验

在相同条件下，在pH为7.0的0.1 mol/L PBS溶液中，考察了当其他抗生素或其他药物分子存在时C-dots的荧光强度变化，包括硫酸卡那霉素（KANA）、头孢他啶（TAZ）、头孢曲松钠（CTR）、头孢呋辛钠（CFX）、抗坏血酸（AA）、多巴胺（DA）、尿酸（UA），见图8。氯霉素能大幅度降低C-dots的荧光强度，头孢类抗生素也能降低荧光强度，但效果并不如氯霉素明显，而硫酸卡那霉素与其他药物分子则只能引起非常小的荧光减弱。这意味着C-dots可应用于选择性地检测氯霉素，其突出的选择性与特异性可能与氯霉素对C-dots表面的羧基具有更强的亲和力有关[19]。

3讨论

C-dots的制备方法根据碳源的不同，分为“自上而下”合成法和“自下而上”合成法。

1）“自上而下”合成法是指将大尺寸的碳源通过物理或者化学的方法剥离出尺寸很小的C-dots，如通过电弧放电、激光消融、电化学刻蚀等手段将碳纳米管、碳纤维、石墨棒、碳灰和活性炭等富碳物质进行分解并最终形成C-dots[20-21]。“自上而下”的方法一般需要特定的反应条件，过程繁杂且操作复杂，较难实现C-dots的可控制备。

2）“自下而上”合成法利用有机小分子等尺寸很小的碳材料合成出C-dots。如采用柠檬酸、聚乙二醇、尿素、离子液体等有机小分子或低聚物，常见的合成方法有化学氧化法、燃烧法、水热/溶剂热法、微波合成法、模板法、电化学法等[22]。 “自下而上”方法制备C-dots，反应条件温和，易于纯化分离，制备C-dots产率高，具有明显的优势。电化学法通过控制有机小分子碳化的电极电位和电流密度，可实现C-dots的“自下而上”可控制备，具有成本低、操作简便、反应条件温和，C-dots产率高，对环境破坏较小等优点[12，23]。WANG等[13]在室温（25 ℃）下，以甘氨酸为碳源，在NH4OH水溶液中，对2个Pt电极之间施加10 V碳化2 h，使甘氨酸发生电化学反应，形成具紫外光激发下发出淡黄色荧光的C-dots。目前，采用电化学碳化方法分别以多种有机小分子为碳源成功制备C-dots[12-14]，但采用常见且价格低廉的葡萄糖为碳源制备具有功能化荧光的C-dots鲜见报道。

氯霉素作为一种抑菌性广谱抗生素，对革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌均有抗菌作用，常用于治疗伤寒，副伤寒和厌氧菌感染，也可用于敏感微生物所致的各种感染性疾病的治疗。因其对骨髓造血机能具有严重的抑制作用，现已对其临床应用做出严格控制并将其被列入食品动物中禁止使用的药品及其他化合物清单[24]。因此，建立一种快速、准确、简便的氯霉素含量测定方法具有非常重要的意义。高效液相色谱法、电泳法、高效液相色谱-质谱联用、酶联免疫法是传统的氯霉素检测方法，这些方法耗费时间长、仪器昂贵、专业要求高，并需要复杂的样品前处理过程，对于氯霉素检测实际应用效率低，不适用于氯霉素快速现场检测[25-26]。

4结论

1）通过电化学碳化葡萄糖的方法成功制备C-dots，这种制备方法操作简便、原料易得、成本低、效率高。所制備的C-dots在紫外光的激发下发射蓝色荧光，且具有良好的荧光性能以及光学稳定性。

2）基于氯霉素对C-dots荧光（激发/发射波长分别为345/450 nm）的猝灭作用（C-dots无需进一步化学修饰），所制备的C-dots可作为一种免标记的荧光探针用于氯霉素检测，氯霉素荧光传感器的检测线性范围为0.1～5.0 mmol/L，检测限为0.016 mmol/L，该检测方法快速、灵敏、选择性好。

3）采用“自下而上”的电化学法，以葡萄糖为碳源制备C-dots研制荧光传感器，并初步应用于氯霉素含量的检测，为C-dots用于荧光传感检测药物分子提供理论依据，为实现氯霉素检测提供参考。

参考文献：

[1]CHAN K K， YAP S H K， YONG K T. Biogreen synthesis of carbon dots for biotechnology and nanomedicine applications[J]. Nano-Micro Letters， 2018， 10 （72）： 1-46.

[2]张道涵， 刘磊. 荧光碳点的制备方法及其在生物医药领域应用的研究进展[J]. 化学通报， 2023， 86（1）： 23-33， 22.

[3]何稳， 田丹阳， 孔令娇， 等. 维生素C碳点对水产养殖主要病原菌的抗菌性能及其生物相容性[J]. 水产学报， 2022， 46（5）： 848-856.

[4]冯建海， 李丽萍， 李胜英. 基于碳量子点荧光法测定药品中链霉素的含量[J]. 食品研究与开发， 2022， 43（6）： 142-148.

[5]黄杨， 高田毅， 朱宏星， 等. 基于生物基质碳点构建荧光探针用于腌腊肉制品中亚硝酸盐的检测[J]. 食品工业科技， 2022， 43（14）： 354-361.

[6]范子燕， 刘正杰， 张瑞龙， 等. 溶酶体靶向荧光碳点的制备及细胞成像应用[J]. 分析化学，

2021， 49（7）： 1208-1217.

[7]张晓彤， 王晓通， 谢晓程， 等. 氯霉素在动物源食品中的残留分析研究进展[J]. 中国兽医科学， 2021， 51（7）： 920-924.

[8]周莹莹， 刘定舟， 张丹鹤， 等. 超高效液相色谱-串联质谱法测定动物源性食品中的氯霉素和地塞米松的药物残留[J]. 现代食品， 2022， 28（13）： 208-211.

[9]TAN Z J， XU H， LI G， et al. Fluorescence quenching for chloramphenicol detection in milk based on protein-stabilized Au nanoclusters[J]. Spectrochimica Acta Part A Molecular & Biomolecular Spectroscopy， 2015， 149： 615-620.

[10]YAN Z， SHU J， YU Y， et al. Preparation and application of carbon dots in chloramphenicol determination[J]. Journal of China Pharmaceutical University， 2015， 46（3）： 322-327.

[11]JALILI R， KHATAEE A. Application of molecularly imprinted polymers and dual-emission carbon dots hybrid for ratiometric determination of chloramphenicol in milk[J]. Food and Chemical Toxicology， 2020， 146： 111806.

[12]HOU Y X， LU Q J， DENG J H， et al. One-pot electrochemical synthesis of functionalized fluorescent carbon dots and their selective sensing for mercury ion[J]. Analytica Chimica Acta， 2015， 866： 69-74.

[13]WANG C I， WU W C， PERIASAMY A P， et al. Electrochemical synthesis of photoluminescent carbonnanodots from glycine for highly sensitive detection of hemoglobin[J]. Green Chemistry， 2014， 16（5）： 2509-2514.

[14]DENG J H， LU Q J， MI N X， et al. Electrochemical synthesis of carbon nanodots directly from alcohols[J]. Chemistry， 2014， 20（17）： 4993-4999.

[15]RATEB A， GHUBISH Z， ABDEL HAKIEM A F， et al. A multifunctional sensing of two carbon dots based on diaminonaphthalenes for detection of ofloxacin drug[J]. Journal of Photochemistry and Photobiology A： Chemistry， 2023， 443： 114867.

[16]WEI W， HUANG J， GAO W L， et al. Carbon dots fluorescence-based colorimetric sensor for sensitive detection of aluminum ions with a smartphone[J]. Chemosensors， 2021， 9（2）： 25.

[17]TAO H L， LIAO X F， SUN C， et al. A carbon dots-CdTe quantum dots fluorescence resonance energy transfer system for the analysis of ultra-trace chlortoluron in water[J]. Spectrochimica Acta Part A Molecular & Biomolecular Spectroscopy， 2015， 136（Pt C）： 1328-1334.

[18]LIU J S， WANG L Z， BAO H J. A novel fluorescent probe for ascorbic acid based on seed-mediated growth of silver nanoparticles quenching of carbon dots fluorescence[J]. Analytical and Bioanalytical chemistry， 2019， 411（4）： 877-883.

[19]ZHAO A D， CHEN Z W， ZHAO C Q， et al. Recent advances in bioapplications of C-dots[J]. Carbon， 2015， 85： 309-327.

[20]SHEN L H， WANG C X， ABBAS A， et al. Switching carbon nanodots from single emission to

dualemission by one-step electrochemical tailoring in alkaline alcohols： implications for sensing and bioimaging[J]. ACS Applied Nano Materials， 2019， 2（5）： 2776-2784.

[21]王林鵬， 马玉洁， 周学华， 等. 碳点的制备与应用研究进展[J]. 材料工程， 2015， 43（5）： 101-112.

[22]魏建斐， 马国聪， 刘蕴钰， 等. 蓝色荧光碳点的制备及检测、防伪应用[J]. 精细化工， 2021， 38（11）： 2233-2239.

[23]李腾飞， 李昳玮， 肖璐， 等. 荧光可调控的碳量子点的电化学制备及性质研究[J]. 化学学报， 2014， 72（2）： 227-232.

[24]王花茹， 王加才. 骨髓造血机能的潜在杀手 氯霉素残留危害及检测[J]. 中国动物保健， 2008， 10（10）： 43-44.

[25]李卓， 董文宾， 李娜， 等. 食品中氯霉素残留检测技术研究新进展[J]. 食品工业科技， 2010， 31（4）： 408-411.

[26]尹燕敏， 顾海东， 秦宏兵. 固相萃取-超高效液相色谱三重四级杆质谱联用法测定水中的氯霉素[J]. 环境监控与预警， 2013， 5（5）： 26-28.