Semaphorin 4D促进小鼠皮肤创面愈合的作用和机制

王芳 陈莹 张惠丰 郭树忠 温伟红 刘蓓

[摘 要]目的 研究信號素蛋白Semaphorin 4D（Sema 4D）在小鼠皮肤创面愈合过程中发挥的作用和机制。方法 采用随机分组方式将24只Sema 4D基因敲除小鼠分成实验组（Sema 4D给药组）和对照组（PBS组），同时将12只同窝杂合子小鼠作为正常对照组。所有小鼠制备全层皮肤缺损创面，实验组每个创面局部皮下隔天注射250 ng（50 μl）Sema 4D蛋白/PBS溶液，对照组和正常对照组的小鼠创面以相同体积的PBS溶液进行注射，直至创面完全愈合为止。拍照记录创面愈合情况，术后第3、7、13天取创面组织行HE、MASSON染色及CD34、VEGF免疫组化染色。结果 实验组第5、7、9、11天创面面积小于对照组和正常对照组（P<0.05）；对照组第7、9、11天创面面积大于正常对照组（P<0.05）；实验组创面完全愈合时间短于对照组和正常对照组（P<0.05）；实验组第7天表皮和真皮新生评分、肉芽组织厚度均优于对照组及正常对照组（P<0.05）；实验组第13天胶原染色较其他两组排列紧密有序；在血管生成评价方面，实验组第7、13天CD34表达均高于对照组及正常对照组（P<0.05）。结论 Sema 4D基因敲除小鼠创面愈合速度滞后，外源性给予Sema 4D补充后，可通过促进皮肤创面血管化，发挥促创面愈合的作用。

[关键词] Sema 4D；血管化；创面愈合

[中图分类号] R-33 [文献标识码] A [文章编号] 1004-4949（2024）06-0032-05

基金项目：1.陕西省2021年自然科学基础研究计划（编号：2021JQ-784）；2.陕西省西安市科技计划项目（编号：21YXYJ0129）；3.陕西省自然科学基础研究计划（编号：2022JM-528）；4.2021年医学院校级科研创新团队（编号：2021TD14）

Effect and Mechanism of Semaphorin 4D in Promoting Skin Wound Healing in Mice

WANG Fang1，2， CHEN Ying2， ZHANG Hui-feng2， GUO Shu-zhong3， WEN Wei-hong1， LIU Bei4

（1.Institute of Medical Research， Northwestern Polytechnical University， Xian 710072， Shaanxi， China； 2.Department of Plastic Surgery and Burn Surgery， the First Affiliated Hospital of Xian Medical College， Xian 710077， Shaanxi， China； 3.Xian International Medical Center Plastic Surgery Hospital， Xian 710100， Shaanxi， China； 4.Department of Medical Technology， Xian Medical University， Xian 710021， Shaanxi， China）

[Abstract]Objective To investigate the role and mechanism of Semaphorin 4D， a signaling protein， in the healing process of mouse skin wounds. Methods A total of 24 Sema 4D gene knockout mice were randomly divided into an experimental group （Sema 4D treatment group） and a control group （PBS group）， with 12 heterozygous mice from the same litter as the normal control group. All mice were prepared with full-thickness skin defect wounds， and each wound in the treatment group was subcutaneously injected with 250 ng （50 μl） Sema 4D protein/PBS solution every other day. The wounds of mice in the PBS group and normal control group were injected with the same volume of PBS solution until the wounds were completely healed. The wound healing was recorded by photographing. On the 3rd， 7th and 13th day after operation， the wound tissue was taken for HE， MASSON staining and CD34， VEGF immunohistochemical staining. Results The wound area of the experimental group was smaller than that of the control group and the normal control group on the 5th， 7th， 9th and 11th day （P<0.05）. The wound area of the control group was larger than that of the normal control group on the 7th， 9th and 11th day （P<0.05）. The wound healing time of the experimental group was shorter than that of the control group and the normal control group （P<0.05）. On the 7th day， the epidermal and dermal regeneration scores and granulation tissue thickness scores of the experimental group were better than those of the control group and the normal control group （P<0.05）. The collagen staining of the experimental group was more closely and orderly than that of the other two groups on the 13th day. In terms of angiogenesis evaluation， the expression of CD34 in the experimental group was higher than that in the control group and the normal control group on the 7th and 13th days （P<0.05）. Conclusion The wound healing rate of Sema 4D knockout mice is delayed. Exogenous supplementation of Sema 4D can promote skin wound vascularization and promote wound healing.

[Key words] Sema 4D； Vascularization； Wound healing

创面愈合（wound healing）是一种复杂而精细的动态生理过程，需要多细胞、多分子的共同作用。正常创面的愈合过程包括止血期、炎症期、组织增生期、塑型期4个阶段。血管生成在创面愈合中发挥关键作用，VEGF等多种因子的表达在其中发挥重要的作用[1]。Semaphorin 4D（Sema 4D），又称CD100，是Ⅳ类信号素家族成员，Sema 4D受体Plexin-B1表达于内皮细胞表面，Sema 4D能够发挥抑制内皮细胞凋亡、促进内皮细胞迁移及微血管形成的作用[2]。本研究将Sema 4D基因敲除小鼠制备创伤愈合动物模型，利用重组表达的Sema 4D创面局部给药，验证Sema 4D对创面愈合发挥的作用，并从血管生成的角度探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 重组表达的小鼠Sema 4D分子（Vaccinex，美国）；Masson染色试剂（珠海贝索生物技术有限公司，生产批号：C220701，规格：5×20 ml）；CD34抗体试剂（武汉博士德生物工程有限公司，规格：500 μg/ml）；VEGF抗体试剂（美国Abcam公司，规格：40 μl）；磷酸盐缓冲液PBS片（美国Thermo Fisher Scientific公司，规格：100片）。

1.2 实验动物 C57BL/6J背景的Sema 4D基因敲除鼠（24只）及杂合子对照（12只）由空军大学免疫教研室惠赠，饲养于西京整形医院实验动物中心，动物实验严格按照西京医院整形外科实验动物管理规范执行，本研究得到西安医学院医学伦理审查委员会批准，伦理审批号：XYLS2021187。

1.3 方法

1.3.1动物分组及模型构建 选取24只Sema 4D基因敲除小鼠（Sema 4D-/-）随机分为实验组（Sema 4D给药组）和对照组（PBS组），同时将12只同窝杂合子（Sema 4D+/-）小鼠作为正常对照组。各组小鼠均制备全层皮肤缺损模型。异氟烷吸入麻醉小鼠，除毛消毒小鼠的背部，再以脊椎为中线，在靠近颈侧的背部用打孔器给每只小鼠制备4个直径5 mm的圓形全层创面。

1.3.2创面处理 Sema 4D-/-小鼠创面制备后，实验组每个创面局部皮下隔天注射Sema 4D蛋白/PBS溶液（50 μl）250 ng。对照组（Sema 4D-/-）和正常对照组（Sema 4D+/-）给予同体积的无菌PBS。每组小鼠在创面完全愈合前，均隔天注射给药。

1.3.3创面愈合评价 术后每天观察并拍照记录各组小鼠创面愈合情况，计算创面愈合率，计算公式：创面愈合率=（1-观察日创面面积/初始创面面积）×100%，并记录创面完全闭合时间。

1.3.4取材 术后第3、7、13天每组处死3只小鼠并取材，其余小鼠观察至创面最终愈合。小心剥离包括肉芽组织在内的全层创面及周围正常皮肤组织。取材以多聚甲醛固定，常规程序脱水、包埋、切片。

1.3.5 HE染色和Masson染色 蜡块标本切4 μm薄片，行常规HE染色和Masson染色。由病理医生对切片进行表皮和真皮再生情况的评估，具体标准参照Niwano Y等[3]和Altavilla D等[4]四分量表。

1.3.6免疫组化染色 常规免疫组化染色标记CD34和VEGF。每一高倍镜视野下计数新生血管的数目或阳性细胞染色数目，每张切片随机选取5个最大范围的覆盖创面组织的视野进行拍照并统计。

2 结果

2.1 创面愈合情况 三组术后前3天创面面积比较，差异无统计学意义（P>0.05）；实验组第5、7、9、11天创面面积小于对照组和正常对照组（P<0.05）；对照组第7、9、11天创面面积大于正常对照组（P<0.05），见图1。实验组创面完全愈合时间为（13.00±1.23）d，短于对照组的（17.25±1.14）d及正常对照组的（14.75±0.97）d（P<0.05）。

2.2 HE染色和Masson染色结果 术后第3天，新生表皮和真皮在各组创面组织均未见到，炎性细胞浸润较多。相比于对照组，实验组第7天创面上皮化程度较高，肉芽组织层较厚，血管数量较多，炎性细胞浸润减少，正常对照组也可见新生表皮覆盖，肉芽组织较厚，血管丰富，炎性细胞数目较少。实验组第7天表皮和真皮新生评分、肉芽组织厚度均高于对照组和正常对照组（P<0.05）；实验组第13天创面已经被新生表皮组织完全覆盖，表皮较薄，真皮层内有与表皮平行分布的胶原蛋白纤维，新生血管数目及炎性细胞数目减少；而对照组表皮反应性增厚，炎性细胞数目较多，位于上皮化区域，新生血管可见；正常对照组创面上皮化尚未完全，真皮层增厚，与第7天相比，血管和炎性细胞浸润的数量都有所下降。实验组第13天表皮细胞厚度、表皮和真皮再生评分及肉芽组织厚度均低于对照组和正常对照组（P<0.05）。三组不同时间点的表皮厚度、表皮和真皮再生评分及肉芽组织厚度统计见图2A～图2C。Masson染色显示，创面组织在造模术后的第3天呈现出稀疏、排列紊乱的胶原结构。第7天，各组胶原密度均有所提高，特别是实验组可见大量成纤维细胞增殖，胶原纤维束变粗，排列也更加规整。相比之下对照组稀疏而杂乱。正常对照组织中，成纤维细胞数量增加，胶原纤维束增粗，但排列缺乏规则。第13天，实验组胶原纤维排列较为有序，密度增加；而对照组排列紊乱，纤维成熟度较低；正常对照组胶原蛋白纤维排列较之前更加紧密均匀，见图2D。

2.3 血管生成评价 在创面模型建立后的第3天，免疫组化标记CD34显示各组创面仅有少量新生血管。各组第7天新生血管数量均增多，该时间点实验组较其它两组微血管数目增多（P<0.05）。第13天，各组微血管数目均下降，实验组微血管数目仍高于其他两组（P<0.05），见图3A。各组VEGF表达呈现第3天较低、第7天升高、13天略降低趋势，但与CD34染色不同的是，正常对照组各个时间点创面VEGF表达均高于其它两组（P<0.05），见图3B。

3 讨论

伤口愈合困难是临床工作中的一大难题，随着社会老龄化问题日益突出，其发病率也呈逐年上升趋势，伤口长期不愈合会严重影响患者的身心健康，也造成了医疗费用支出的日益增长，给患者及其家庭和社会带来了巨大负担[5]。局部组织缺血是慢性创面难以愈合的原因之一，可通过改善局部组织缺血状况来进行治疗[6]。

Sema 4D分子是信號素家族的成员，已有研究表明[7]，其在体外和外均能诱导血管生成。本研究拟探讨Sema 4D分子的缺失、及外源补充是否对创面愈合进程造成影响，并初步探讨其机制。本研究观察到Sema 4D敲除小鼠创面愈合进程明显延迟，而给敲除小鼠外源补充Sema 4D分子能加速创面愈合速度，证明了该分子在创面愈合中的重要作用。通过对血管化指标的评价，表明Sema 4D的外源补充能够促进创面新生血管的形成。其中CD34毛细血管内皮细胞祖细胞标志，可代表微血管数目[8]。本研究发现在各个时间点，Sema 4D给药后创面微血管数目较对照组和正常对照组均增高。VEGF作为促血管生成的最强生长因子[9]，Sema 4D给药后相较PBS对照组，VEGF的表达也增高，证实了Sema 4D可能通过促血管生成作用促进创面愈合。前期研究发现[10]，在Ⅱ型糖尿病小鼠慢性创面模型中，局部给与Sema 4D药物，能够通过促血管生成作用促进创面愈合，与本研究结论一致。

关于Sema 4D发挥促血管生成及促进创面愈合的机制，已知高亲和力受体PlexinB1主要在非免疫细胞如内皮细胞和上皮细胞表达[11]。PlexinB1的细胞内段有多个酪氨酸磷酸化的位点，及GAP和PDZ结合结合域[12]，能够通过调节PI3KAKT、MAPK 等信号通路发挥生物血作用[13-16]。因此，推测Sema 4D可能通过与血管内皮细胞上的受体PlexinB1结合后，通过调节PlexinB1下游信号通路促进创面新生血管的形成，从而加快创面愈合速度。

综上所述，敲除Sema 4D的小鼠创面愈合较杂合子正常小鼠创面愈合延迟；外源性给予Sema 4D补充后，创面的愈合过程可以通过促进创面新血管的生成而加速。Sema 4D可能能够作为临床慢性难愈创面治疗的一项潜在的药物。

[参考文献]

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收稿日期：2023-12-25 編辑：扶田