肺宁汤对急性放射性肺炎大鼠炎症因子的影响*

刘广梅

胸部肿瘤在放射治疗中肺组织接受较高剂量或较大容积照射,易发生放射性肺炎,直接或间接导致病理性改变,表现为炎症介质释放,细胞因子活化,放射性肺炎为胸部放疗常见的并发症,发病率约为10%[1,2]。辅助性T细胞17(Th17细胞)通过分泌细胞因子促进炎症性疾病发生,调节性T 细胞(Treg 细胞)可抑制炎症反应的发生,Th17/Treg 细胞在机体内存在动态平衡[3,4]。Th17/Treg失衡参与了重症肺炎的发生发展,检测外周血Th17和Treg的百分率及其相应细胞因子水平对评估重症肺炎的病情和预后有重要的临床意义[5]。核因子-κB(NF-κB )为具有多种功能的核转录因子,能够参与多种基因启动子,在肺部疾病、感染、炎症反应时NF-κB 被激活,而NF-κB 通路中p65和 IκBα 在肺炎中发挥关键作用[6,7]。有研究发现,NF-κB和PI3K-Akt通路参与调控肺炎链球菌HSP40诱导BMDM免疫应答的过程[8]。肺宁汤为新乡医学院第三附属医院治疗肺炎的院内协定方,具有清热解毒、养阴清肺功效,具有较好的临床疗效,但其作用机制尚不明确。本研究探讨肺宁汤对急性放射性肺炎模型大鼠细胞炎症因子、外周血 Th17/Treg 平衡及NF-κB 通路的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料于北京维通利华实验动物技术有限公司采购SD大鼠,雄性,体质量(220±20)g,鼠龄8～10周,生产许可证(SCXK-[京]2012-0001),动物合格证号:110011191100175。12 h昼夜节律饲养,自由饮水进食,符合《实验动物管理条件》要求。

肺宁汤药物组成:牛蒡子10 g,白花蛇舌草10 g,黄芩10 g,麻黄10 g,杏仁15 g,麦冬15 g,熟地黄10 g,连翘15 g,苦参10 g,川贝母10 g,黄精10 g,鱼腥草10 g,甘草10 g。各味药材均有院内中药房提供,药材加水煎煮2次,浓缩至1 ml含1 g原药材的药液。地塞米松片(广东华南药业集团有限公司,生产批号:20220412),加生理盐水配置成0.125 mg/ml的溶液。HE染色液(上海研域化学试剂有限公司),IFN-γ、TNF-α和IL-6检测试剂盒(北京中同生物技术有限公司),CD4、CD25、Foxp3、IL-17A抗体试剂盒(美国BD公司),抗体 p65和IκBα蛋白一抗(南京建成生物科技公司),二抗(河北博海生物工程开发有限公司),显色液(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

Precise型医用直线加速器(瑞典医科达公司),RM2235型病理切片机(德国莱卡公司),NIKON CI-S型倒置显微镜(日本尼康公司),TD5A-WS/TD5AWS型低速离心机(湖南湘仪离心机有限公司),ELx800酶标仪(美国伯腾仪器有限公司),FACSCalibur 型流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组与给药40只SD大鼠除空白组的30只,水合氯醛腹腔麻醉,平躺仰卧于照射台上,充分暴露胸部,固定,Precise型医用直线加速器调整照射野,上至大鼠前肢两腋窝中点连线,下至胸骨剑突水平,直线加速器进行全胸单次照射,源靶距为100 cm,剂量率为250 cGy/min,总剂量为16 Gy[9]。照射完毕大鼠自然苏醒后,常规饲养。空白组近麻醉固定,同等条件下肺部假照射。与照射后第2天开始干预,空白组和模型组给予生理盐水灌胃,试验组给予肺宁汤灌胃,阳性组给予地塞米松灌胃,剂量分别为5 ml/kg,每日1 次,连续给药14 d。

1.2.2 标本采集给药2周后,取各组大鼠,麻醉,固定于木板上,腹主动脉取血,肝素钠抗凝管留取2 ml,然后摘取右肺中叶,10%福尔马林溶液固定,摘取余肺,液氮冷却后-86 ℃保存。

1.2.3 HE染色取10%福尔马林溶液固定的右肺中叶,不同浓度的乙醇脱水,二甲苯固定,石蜡包埋,切片,厚度为5 μm,烤片,二甲苯脱蜡,乙醇水化,苏木精染色,盐酸乙醇溶液中分化,自来水冲洗返蓝,伊红染色,中性树胶进行封片,显微镜下观察。

1.2.4 炎症因子检测取肝素钠抗凝管留取2 ml,离心,取上清,采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定各组大鼠血清干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)水平,按照说明书操作。

1.2.5 流式细胞检测取肝素钠抗凝管留取2 ml,离心,取中间部分,分为2份,一份行外周血 Th17细胞含量检测,加入溶血素,离心,加入磷酸盐缓冲液洗涤2次,重悬细胞,避光孵育,先染表面抗体CD4及同型,破膜后再染IL-17,上机检测分析。一份行Treg细胞含量检测,10%溶血素裂解红细胞,先染表面抗体CD4、CD25,破膜后再染Foxp3,上机检测分析。

1.2.6 Western Blot检测取新鲜冷冻肺组织,适量,加入含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液,肺组织匀浆,离心,取上清,BCA测定蛋白浓度,匀浆上清液与上样缓冲液等量混合,电泳,转膜,封闭,一抗4 ℃过夜,二抗室温孵育1 h,漂洗,ECL曝光液曝光,凝胶成像系统检测,测定各组条带灰度值,按照说明书操作。

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织病理学形态比较空白组大鼠肺组织结构正常,未见炎性细胞浸润。模型组肺泡壁增宽,肺泡壁结构不完整,炎性渗出水肿明显,肺泡内大量炎性细胞,可见大量巨噬细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润,肺泡壁结构不完整,纤维素样渗出物,局灶性坏死。试验组和阳性组充血、水肿、渗出等显著改善,炎细胞浸润减轻,可见少量炎性细胞,间质轻度水肿,肺泡壁结构相对完整。见图1。

图1 大鼠肺组织病理改变比较(HE染色,x400倍)

2.2 各组大鼠炎症因子水平比较与空白组比较,模型组IFN-γ、TNF-α和IL-6水平显著升高(P<0.05),提示急性放射性肺炎模型大鼠炎症因子水平显著升高。治疗后,与模型组比较,试验组和阳性组IFN-γ、TNF-α和IL-6水平显著降低(P<0.05),但试验组和阳性组大鼠炎症因子水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠炎症因子水平比较 (只,

2.3 各组大鼠外周血Th17和Treg细胞含量比较与空白组比较,模型组外周血 Th17细胞含量显著升高,Treg细胞含量显著降低(P<0.05),提示急性放射性肺炎模型大鼠 Th17/Treg 细胞失衡。治疗后,与模型组比较,试验组和阳性组Th17细胞含量显著降低,Treg细胞含量显著升高,且试验组优于阳性组(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠外周血 Th17和Treg细胞含量比较 (只,

2.4 各组大鼠p65和IκBα蛋白表达水平比较与空白组比较,模型组肺组织p65蛋白表达水平显著升高,IκBα蛋白表达水平显著降低(P<0.05),提示急性放射性肺炎模型大鼠 肺组织p65显著升高,IκBα显著降低。给予肺宁汤和地塞米松灌胃2周后,与模型组比较,试验组和阳性组肺组织p65蛋白表达水平显著降低,IκBα蛋白表达水平显著升高,且试验组优于阳性组(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠组织p65和IκBα蛋白表达水平比较

3 讨论

放射性肺炎为放疗过程中常见的并发症,西医治疗以糖皮质激素及免疫抑制剂为主,虽有疗效,但不良反应较多,中医药治疗放射性肺炎优势明显,疗效显著,为放射性肺炎的防治提供了新思路。放射性肺炎属中医“肺痿、肺痹”等范畴,外来火热邪毒,热邪犯肺可耗伤气血阴津,导致肺失濡养,造成干咳、气喘、出血等典型症状,治宜清热解毒,养阴润肺[10,11]。研究发现,清肺养阴活血方联合泼尼松龙能提高放射性肺炎患者临床疗效,明显缓解患者症状,改善氧化应激状态,增强机体免疫功能,安全可靠[12]。研究发现,麻杏石甘汤联合苇茎汤治疗放射性肺炎急性期比单纯激素抗感染治疗效果显著[13]。前期临床也发现具有清热解毒、养阴清肺功效肺宁汤对放射性肺炎具有较好的临床疗效,但其作用机制尚不明确。

Th17和Treg 是近年发现的CD4+T细胞的亚群,参与调节机体的免疫功能并维持其动态平衡,促炎性Th17细胞与抑制炎症性Treg细胞的平衡在自身免疫性疾病和肿瘤免疫中发挥重要作用[14]。研究发现,放射性肺炎形成过程中出现Th17/Treg失衡,这为进一步揭示放射性肺炎的发病机制及临床寻找放射性肺炎的预测因子提供了重要信息。NF-κB 为能特异性结合基因启动子或增强子的调节因子,以p65及p50二聚体形式存在,受到刺激时IκBα 被降解,释放NF-κBp65,调节炎症相关基因的表达。早期放射性肺损伤NF-κB p65、IL-1β的mRNA表达明显上调,IκBα表达下调,抑制NF-κB p65、减轻炎症反应可能减缓放射性肺损伤[15]。

本研究发现,试验组和阳性组少量炎性细胞,间质轻度水肿,肺泡壁结构相对完整,IFN-γ、TNF-α和IL-6水平显著降低,Th17细胞含量显著降低,Treg细胞含量显著升高,肺组织p65蛋白表达水平显著降低,IκBα蛋白表达水平显著升高。肺宁汤由牛蒡子、白花蛇舌草等13味中药材组成,方中牛蒡子疏散风热、宣肺透疹、消肿解毒,有抗肿瘤、抗炎、抗糖尿病、抗菌及抗病毒作用;白花蛇舌草清热、利湿、解毒,具有增强免疫功能和抑瘤等作用;黄芩清热燥湿、泻火解毒,麻黄发汗解表、宣肺平喘、利水消肿;杏仁降气止咳平喘,具有镇咳、平喘、增强人体免疫力、抑制和杀死癌细胞作用;麦冬养阴润肺、益胃生津,具有抗疲劳、清除自由基、提高细胞免疫功能作用;熟地黄补血滋阴,益精填髓;连翘清热解毒、散结消肿;川贝润肺止咳、化痰平喘,用于肺虚、久咳、肺痈、瘰疬、痈肿等,黄精补脾、润肺生津,具有抗病原微生物、抗疲劳、抗氧化作用;鱼腥草清热解毒、消肿疗疮,具有增强免疫力、抗肿瘤、抗病原微生物等药理作用,甘草调和诸药药性。全方共奏清热解毒、养阴清肺功效。

综上所述,肺宁汤可保护急性放射性肺炎模型大鼠肺组织,其机制可能与降低细胞炎症因子,调整 Th17/Treg 细胞平衡,抑制NF-κB 通路蛋白表达有关。