免疫荧光技术在近视相关生物标志物检测中的应用进展

赵宇辉 毕宏生 孙华跃 李文慧 田庆梅 卢秀珍

1.山东中医药大学眼科与视光医学院，山东济南 250014；2.山东中医药大学附属眼科医院 山东省眼病防治研究院山东省中西医结合眼病防治重点实验室，山东济南 250002；3.山东中医药大学第一临床医学院，山东济南 250014

免疫荧光（immunofluorescence，IF）技术亦称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种技术；它基于抗原、抗体相互反应的原理，将已知的抗原或抗体用荧光基团（荧光素）标记，再将这种已标记的抗原或抗体与细胞或组织内目标抗原或抗体结合，形成荧光复合体被特定波长的光激发，从而被荧光显微镜捕捉[1-3]。IF 已被广泛应用于细菌病毒和寄生虫的鉴别诊断、部分疾病免疫学机制的研究、器官移植的鉴定、抗原组织定位等方面。近视是屈光不正中最常见的一种疾病，是导致低视力的主要原因，严重损害人们的视觉质量。近年来，IF 在近视研究领域中发挥了巨大的作用。本文就近年来IF 在近视相关的生物标志物检测中的应用进行综述，以供研究参考。

1 IF 概述

1.1 IF 的组成和基本原理

IF 主要由直接IF、间接IF、多重IF 和补体参与的IF 等组成。直接IF 是指特异性抗体标记荧光素后直接与目标抗原结合，形成抗原-抗体复合物而被鉴定的方法[1]。但该方法抗体均需荧光素标记，其敏感性较低，应用相对有限。间接IF 是指特异性抗体与目标抗原（一抗）结合后，再加入荧光素标记的二抗，结合形成免疫复合物而被鉴定的方法。间接IF 因其有较好的敏感性和特异性，在临床和实验研究中应用广泛[4]。多重IF 则需进行多重荧光染色，此法可同时检测多种生物标志物[5]。补体参与的IF 是指利用补体反应，形成了抗原-抗体-补体荧光复合物，荧光显微镜下所见到的发出荧光的部分即是抗原所在的部位。

1.2 IF 的发展历程

IF 的雏形，最早可追溯到1897 年，俄国科学家Metchnikoff 用毒素作为示踪剂，研究破伤风毒素在鸡组织中的定位[6]。人们开始尝试追踪可溶性抗原和抗体在动物体内的分布。1941 年Coons 等[7]首次在肺组织中使用荧光素标记了抗肺炎球菌抗体，这代表着IF的诞生。20 世纪60—90 年代，IF 被风湿科、眼科、骨科等学科引入并广泛应用。近年来，随着其他领域科技的快速发展，IF 与探针化学、电子计算机和激光共聚焦显微镜等结合，使IF 更加灵敏；时间分辨荧光免疫分析法和荧光偏振免疫分析法等IF 分析方法的出现，使得IF 的定量检测更加准确[8]。IF 已成为医学基础研究和疾病诊断的重要手段。

2 IF 在近视相关生物标志物检测中的应用

2.1 直接IF 在近视相关生物标志物检测中的应用

一项研究对形觉剥夺性近视（form-deprivation myopia，FDM）大鼠予以0.010%和0.025%的阿托品滴眼治疗，并应用直接IF 检测其视网膜和巩膜中缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）蛋白的表达[9]。实验选用HIF-1α 荧光抗体为染色抗体进行检测，发现2 个剂量组HIF-1α 蛋白表达量均有降低趋势，低浓度阿托品可能通过减少视网膜和巩膜上HIF-1α 等基因及蛋白表达量来降低巩膜延展性，延缓近视进展。此外，有研究采用直接IF 对视网膜静脉阻塞小鼠视网膜缺氧区域进行可视化，腹腔注射缺氧探针哌莫硝唑，凝集素荧光抗体等抗体对视网膜静脉缺氧细胞进行染色[10]。前述研究表明，直接IF 是探究眼部缺氧的有效手段，为近视缺氧的研究提供了新思路。

在该装置的内部，包含一个蓄电池、抽气泵、气体传感器、气体凹槽通道、信息处理系统等，因为SF6气体的密度大约是空气的五倍，因此空气经过长凹槽时SF6会通过长凹槽下沉到隔离板下方，隔离板下方的气体传感器会检测GIS设备内的气体的浓度通过控制面板将其显示在显示屏上。其内部结构如图一(b)所示。

2.2 间接IF 在近视相关生物标志物检测中的应用

间接IF 因其特异性较好受到许多研究者们的青睐。一项研究对正常小鼠眼组织进行了间接IF 检测，肿瘤坏死因子受体超家族成员TNFRSF21 的抗体作为一抗，和缀合荧光染料的二抗一起孵育[11]。结果显示TNFRSF21 在小鼠眼中强烈表达，对高度近视具有致病性。Tian 等[12]将抗视紫红质抗体作为一抗来检测Glra2 基因敲除小鼠视网膜和质粒转染过表达的原代视网膜细胞中视紫红质的水平，Glra2 被鉴定为高度近视新的致病基因。另有研究应用间接IF 验证PPEF2 基因在FDM 小鼠视网膜、293T 细胞和ARPE-19 细胞的表达情况和其与高度近视表型的关系[13]。该研究使用PPEF2 抗体、山羊抗小鼠IgG 孵育，结果明确了PPEF2 在小鼠视网膜的位置，并证明了PPEF2 是高度近视的致病基因。因此，IF 在鉴定近视及其他眼病致病基因方面表现出巨大作用，为近视基因类标志物的检测提供了科学方法。

I 型胶原蛋白（type Ⅰcollagen，Col-I）是巩膜外基质的主要成分，是影响巩膜重塑的重要因子。Liu 等[19]利用间接IF 检测Col-Ⅰ、α-平滑肌肌动蛋白和纽蛋白在FDM 豚鼠脉络膜上的表达情况，利用倒置荧光显微镜观察IF 结果，发现tRF-22 可通过调节脉络膜血管功能在近视进展中发挥保护作用。有研究使用miRNA-29a 模拟物和其抑制剂转染人胎儿巩膜成纤维细胞，应用间接IF 检测热休克蛋白47、Col-ⅠA1、Smad3 蛋白等标志物的表达[20]。结果表明，miRNA-29a模拟物抑制了热休克蛋白47、Col-Ⅰ等蛋白的表达，促进了巩膜成纤维细胞的凋亡，这表明miRNA-29a会促进巩膜重塑、加快近视发展，为治疗近视的潜在治疗靶点研究提供了新见解。一项研究使用抗Col-Ⅰ抗体和荧光标记的二抗对经Hsa-miR-142-3p 模拟剂和抑制剂转染的人巩膜成纤维细胞进行间接IF 染色[21]。结果表明，Hsa-miR-142-3p 可以降低Col-Ⅰ的表达水平，可能是控制高度近视的靶点。此外，Hsiao等[22]应用Col-Ⅰ抗体作为一抗，检测经紫外线A 模拟日光照射后的人巩膜成纤维细胞Col-Ⅰ的表达，发现紫外线A 可以减少TGF-β 诱导的Col-Ⅰ的产生从而影响近视发展。一项研究予以人巩膜成纤维细胞660 nm 光照干预，并应用间接IF 检测HIF-1α 和Col-ⅠA1 蛋白的表达发现660 nm 光照会下调HIF-1α 表达并促进胶原蛋白合成，且不会造成光损伤[23]。有研究应用间接IF 检测缺氧培养的人巩膜成纤维细胞中IL-6 的表达，该研究发现巩膜成纤维细胞在缺氧条件下过量分泌IL-6，并间接抑制巩膜重塑中巩膜细胞外基质变薄的过程[24]。

因此，IF 可以被应用于检测眼组织Col-Ⅰ和其相关蛋白的表达，为探究影响巩膜重塑和近视进展的因素提供了潜在途径。

有研究应用IF 检测透镜诱导性近视（lensinduced myopia，LIM）和FDM 豚鼠模型视网膜黑视蛋白（melanopsin，MLP）的表达[14]。该研究采用抗MLP 一抗和荧光显色二抗共同孵育，运用激光共聚焦显微镜观察图像，结果表明MLP 与近视的发展存在潜在关联。另有研究向LIM 豚鼠玻璃体腔注射MLP 抗体，使用间接IF 来检测视网膜MLP 的表达[15]。结果表明，MLP 主要表达在豚鼠光敏感视网膜神经节细胞的表面和树突上，对LIM 豚鼠近视发展有抑制作用。这表明IF 有助于近视发展过程中有关蛋白标志物的作用研究，为近视治疗提供新靶点。

双调蛋白（amphiregulin，APG）是近视重要的标志物。间接IF 被一项研究用来检测FDM 豚鼠巩膜中APG 的相对表达量，观察图像发现APG 在FDM 发展过程中表达上调[16]。有研究对原代巩膜成纤维细胞进行间接IF 染色，抗APG、波形蛋白和角蛋白抗体作为一抗参与孵育[17]。该研究发现，APG 通过ERK1/2-MMP2途径参与巩膜重塑，是近视的监测性标志物。有研究者向LIM 豚鼠玻璃体腔注射APG 抗体，兔抗APG 抗体等抗体作为一抗，山羊抗兔IgG 等作为染色二抗检测豚鼠视网膜APG 的表达[18]。该研究发现，APG 可以抑制眼轴的增长，延缓近视过程中巩膜变薄，这一发现为进一步研究APG 在巩膜重塑和近视发生、发展中的作用提供了基础。

在样品的测试方面，由于氧化石墨烯元件的湿敏性能的特性，因此为了达到较好的测试效果则在最为合理室温25摄氏度的环境下进行测试，其测试共测试9种化学溶液，将氧化石墨烯元件置于上方且环境密闭，由此得出测试结果，其测试结果如图表2。

高等职业院校办学主要面向地方产业一线，以学生获得职业技能作为主要培养目标。国务院印发的《关于深化体制机制改革 加快实施创新驱动发展战略的若干意见》，明确了技术创新市场导向机制、成果转化激励政策等，推进了高职院校科研工作的发展。高职院校依托校企合作办学，深化产教融合，推进科研成果转化为社会生产力，对地方产业起到积极的推动作用[1]。然而，我国高职院校科研成果的转化率很低，很多科研成果未得到推广。本文对于高职院校科研成果推广的现状、限制因素进行分析，并研究对应策略，提升高职院校科研成果转化率。

间接IF 在近视药物疗效研究中有巨大的潜在作用。邱宇等[28]向FDM 豚鼠玻璃体内注射抗新生血管药康柏西普，兔抗鼠酪氨酸羟化酶多克隆抗体作为一抗进行免疫荧光染色，发现康柏西普会使FDM 豚鼠视网膜中的酪氨酸羟化酶水平降低，并导致豚鼠眼轴延长、屈光度升高。此外，有研究利用间接IF 定位和检测小胶质细胞标志物Iba1 的表达，并研究中药驻景丸加减方的疗效[29]。FDM 豚鼠被灌胃驻景丸加减方，采用抗Iba1 抗体作为一抗进行IF 试验，通过荧光扫描显微镜摄像系统采集图像。结果发现中药干预组豚鼠视网膜Iba1 表达较近视模型组显著降低，驻景丸加减方可通过抑制小胶质细胞活化抑制视网膜血管病变，从而起到保护视网膜的作用。这些研究表明，IF为中西药物治疗近视的机制和效果研究提供了潜在方法，有利于近视药物的研发。

连接蛋白36 参与形成间隙连接，是细胞间信息交换的重要媒介。有研究采用间接IF 评估FDM 和LIM 豚鼠视网膜内丛状层和外丛状层中连接蛋白36和其磷酸化的量[25]。该研究发现，FMD 豚鼠连接蛋白36 的数量和其磷酸化水平降低，而LIM 则不受影响，这表明FDM 豚鼠视网膜中连接蛋白36 可能通过介导细胞间偶联参与了近视发展。间接IF 使得人们探究细胞间的偶联与近视的相关性成为可能。一项研究运用间接IF 检测LIM 小鼠视网膜中神经元型一氧化氮合酶和S-亚硝基化蛋白的表达[26]。结果发现，在LIM 豚鼠视网膜中这两种蛋白的表达较正常组降低，一氧化氮介导的非经典蛋白S-亚硝基化修饰可能在近视调节中发挥重要作用。另有研究应用间接IF 检测了LIM 豚鼠视网膜色素上皮中mTORC1 蛋白复合体的激活情况[27]。激活的mTORC1 与抗磷酸化P70S6激酶抗体结合，被二抗发出的荧光显示位置。结果表明，mTORC1 可促进眼轴伸长、脉络膜变薄和视乳头周围脉络膜萎缩，从而促进近视发展，mTORC1 是近视治疗手段研究的潜在新目标。

间接IF 也被用来检测钙离子在眼组织的表达。Li 等[30]描述了一种监测FDM 小鼠视网膜水平细胞内Ca2+的水平变化的新型钙荧光系统，抗钙结合蛋白抗体为一抗，驴抗小鼠Alexa Fluor 555 为二抗孵育，运用GCaMP6+钙结合蛋白+/钙结合蛋白+共免疫染色模式来跟踪GCaMP6+的数量和水平细胞的比例，这为检测人眼组织中Ca2+及其他离子表达水平提供了新的方法和可能性。

2.3 多重IF 在近视相关生物标志物检测中的应用

多重IF 是一种利用辣根过氧化酶对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的新兴技术。有研究者用M-视蛋白和S-视蛋白多克隆抗体标记小鼠视网膜整体，使用5 色多重荧光免疫染色试剂盒染色进行荧光染色，发现M-视蛋白过表达会破坏正常的屈光发育并导致近视，而M-视蛋白的缺乏可以保护小鼠免受近视，并促使小鼠出现远视趋势[31]。多重IF 使得复杂细胞群体和组织微环境的分析更为准确和全面，为近视发病机制和治疗方案的研究开辟了新途径。

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3 小结和展望

IF 可以鉴别近视相关的细胞和高度近视的致病基因，检测近视相关目标蛋白和离子在眼组织和细胞中的分布和表达情况，探测近视发展中眼组织的缺氧程度和巩膜重塑的程度，探究近视药物在体内的机制和效果等。因此IF 在近视研究领域中扮演着重要角色，是极具效益的方法和手段。IF 也具有一定局限性。随着时间的推移荧光信号会减少或消失，过多非特异性抗体的结合可能无法准确定位免疫复合物，对显微镜设备要求较高。总的来说，IF 可以帮助人们进一步探究近视及其他眼病的机制和治疗方案，是近视研究领域不可或缺的手段。随着科学技术的不断发展，IF得到不断的完善，今后该技术将被更广泛地应用于生命科学更多领域之中。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。