基质胶提取制备与应用的研究进展

张涵漪，王天一，路惠添，张涛

（北京农学院动物科学技术学院，北京 102206）

0 引言

许多类型的细胞生长和增殖均需要黏附表面，尤其是原代细胞和干细胞，为了其维持稳定的生长分化状态，需要在培养基中添加专门的生长基质[1-2]。基质胶(Matrigel)因含有细胞基底膜几乎所有已知组分，能够为细胞生长发育和功能提供类似细胞外基质的作用，成为应用最广泛的基底膜基质。因其在培养箱中形成凝胶状态，为细胞的三维增殖分化提供了固体细胞外基质构成的三维空间环境[3]，尤其在类器官培养中起到了不可替代的作用[4]。目前，高质量的基质胶产品主要依赖于从国外Corning 等公司进口，近年来由于中美贸易战和新冠疫情等的影响，基质胶在中国曾经大面积缺货，给很多企事业的生产和服务、科研实验等带来严重影响，成为21世纪生命科学研究中最具前景的“卡脖子”生物材料。为了较全面了解基质胶的价值，更好地指导相关实验研究，及为中国基质胶产品的开发提供参考，系统综述了基质胶的提取制备方法及其应用领域。

1 基质胶概述

基质胶是一种可溶性的基底膜基质。1983 年，Hynda Kleinman 等研究一种被称为Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)肉瘤时，将提取制备的基底膜基质产品命名为“基质胶”进行销售。其主要成分包括4种基底膜细胞外基质蛋白，即层黏连蛋白（约占60%）、Ⅳ型胶原（约占30%）、巢蛋白（约占8%）和硫酸肝素蛋白多糖（约占2%～3%），以及生长因子和酶等肿瘤来源蛋白，有成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、类胰岛素生长因子、TGF-β、组织纤溶酶原、金属蛋白酶等[5]。基质胶组分的种类和含量因其提取组织的类型和分化程度而变化，其中层黏连蛋白和Ⅳ型胶原组分的功能多样。层黏连蛋白包括多种亚型，其中层黏连蛋白1 含有多个黏附位点，能够为干细胞、上皮细胞、内皮细胞和肿瘤细胞等多种类型细胞的黏附提供条件。此外，层黏连蛋白1衍生的IKVAV和YIGSR肽促进细胞分化、血管生成、肿瘤生长和转移。胶原蛋白中Ⅳ型胶原最丰富，也发现有I、III、VI和XVIII型等胶原的存在[5]。

在冰箱冷藏或将其中蛋白稀释至较低浓度时，基质胶将以液体状态存在；而在温度高于10℃及其中蛋白浓度不低于3 mg/mL 时，基质胶聚合形成具有生物活性的凝胶状态，能够提供类似于天然细胞外基底膜的结构、组成、物理特性和作用。低浓度的基质胶可用来包被细胞培养器皿，在培养器皿表面形成薄薄的蛋白层，有利于细胞的黏附生长；而基质胶形成凝胶状态时能为细胞的分化提供有利条件，使其在体外呈现近似体内的生长发育状态，尤其为类器官的培养提供不可或缺的载体[6]。

2 基质胶提取制备的研究现状

2.1 基质胶的生物组织来源

在正常组织中，基底膜含量甚微，是一种相对不溶的结构。如前所述，基质胶起源于小鼠EHS肉瘤组织提取物，该肿瘤组织相对温和，在小鼠体内生长迅速，可提供大量的基底膜组分，是当前基质胶提取制备的主要生物组织来源。1944年，瑞典Engelbreth-Holm博士捕获一只野生型小鼠，并切除了肿瘤组织；1961年，美国Swarm博士获得该肿瘤组织并进行了研究[7]。为了纪念Engelbreth-Holm博士的发现，及Swarm博士对该组织的保存与特征研究，将其命名为EHS 肿瘤，在分类上属于低分化软骨肉瘤，在生物学特性上具有明显异质性[8]。此后，层黏连蛋白、硫酸类肝素蛋白多糖等组分逐渐从中得到分离、鉴定，1990年，商品化的基质胶出现。由于EHS 肉瘤细胞难以在体外培养和大规模扩增，所以，基质胶提取制备所需的肿瘤组织需要在小鼠体内接种生长，这也带来了一些有关动物福利等的问题。

为了保护动物福利及降低基质胶生产的组织成本，当前也有利用动物肌肉、皮肤、肝脏、子宫瘤等组织，甚至整只动物尸体进行提取制备基质胶的报道[9]。Danielson 等[10]从EHS 肿瘤组织分离细胞，构建了一个可传40代以上的连续细胞系，该细胞系能够保持EHS肿瘤细胞的表型和生物学特性，具有在小鼠体内诱导EHS 样肿瘤的能力，能够合成层黏连蛋白的A/B链、Ⅳ型胶原、巢蛋白以及基底膜特异性硫酸类肝素蛋白聚糖，认为该细胞作为细胞外基质来源用于检测细胞黏附、迁移和分化方面具有应用价值。Barsky等[11]发现人的腺样囊性癌和卵巢卵黄囊瘤与人其他大多肿瘤不同，它们含有大量的基底膜基质，异体移植给无胸腺小鼠，仍能保持组织特性，尽管只有EHS小鼠肿瘤基质胶产量的一小部分，但通过使小鼠甲状腺肿大可以提高人基底膜基质的产量。Abberton等[12]研究了从骨骼肌组织提取细胞外基质的方法，并成功从小鼠、大鼠、猪和人的骨骼肌中提取了肌质胶(Myogel)，显示了诱导脂肪细胞分化和脂肪形成的潜力。滕以刚等[13]报道，将小鼠或大鼠等动物尸体消毒处理，去除内脏和皮肤，利用剩余组织提取制备了能满足3D细胞培养要求的基质胶，认为其取材方便且产量高。廖传荣等[14]则利用体外培养的纤维肉瘤细胞或骨肉瘤细胞，提取制备了基质胶，认为其具有细胞外基质的主要成分，有利于类器官培养。此外，也有利用全合成材料制备基质胶的报道[11]，但全合成材料往往缺乏细胞生长所需的细胞因子，且生物相容性较差。因此，尽管小鼠EHS 肉瘤作为组织来源制备基质胶仍存在一些问题，但与其他方法相比，其仍是当前基质胶制备的主要组织材料。

2.2 小鼠EHS肉瘤模型的复制

肿瘤的接种传代可以用分散的EHS肿瘤组织，也可以用单细胞悬液，后者可以从美国菌种保藏中心(ATCC)购买获得。重约4 g的EHS肿瘤可以接种给至少10只小鼠，并在接种后3～4周收获。一般使用2—3月龄C57BL/6小鼠，该小鼠是标准的近交系，也是第一个完成基因组测序的小鼠品系，基因背景清晰[15]。雌性小鼠较温顺，比雄性小鼠更容易处理，更适于作为肿瘤受体。Pili等[16]研究表明，老龄小鼠也可以用来生产EHS肿瘤，但是生长速度较慢，且组织学研究表明，细胞外基质相对于肿瘤细胞的面积提高，对细胞模型的作用也有不同，老龄小鼠来源基质胶诱导的血管生成反应小于青年鼠。

肿瘤组织可以用含5% DMSO的PBS冻存于液氮中以后使用，使用冻存的组织时，需要离心除去冻存液，肿瘤的收获期可能会长于新鲜组织。每只小鼠可用16 G 针头接种1 mL 组织悬液，接种部位可在小鼠颈部皮下或者后肢肌肉。一般而言，肿瘤超过4 g时容易出现坏死，为了获得最大的肿瘤组织产量，有必要根据肿瘤大小在接种后不同时间进行收集。由于小鼠日龄、肿瘤生长时间与状态等会影响肿瘤组织的性状，进而对基质胶组分产生影响，故为了提取制备组分和性能稳定的基质胶，小鼠EHS 肉瘤模型复制时，保持小鼠日龄、接种部位、接种剂量、肿瘤组织收集时间等的规范与统一非常必要。

在复制EHS肉瘤模型时，通过模型小鼠饲养条件和小鼠健康状况的变化，改变肿瘤组织内相关组分的含量，则可以制备非常规的基质胶。例如，通过给小鼠饲喂动脉粥样硬化日粮和含β-氨基丙腈日粮，可以制备含高水平Ⅳ型胶原的基质胶，饲喂动脉粥样硬化日粮时，可能会引起小鼠的自发性骨折，所以在饲喂2周后开始注意小鼠健康非常必要[17]。也可以用老龄化小鼠复制EHS模型，提取制备对内皮细胞生存和分化的低支持能力的基质胶，以模拟老龄化环境[16]；来自糖尿病小鼠或者其他疾病模型小鼠肿瘤组织制备的基质胶，其提供的微环境对细胞功能也会有不同影响，例如，高血糖症和氧化应激小鼠来源基质胶对内皮细胞成管实验和血管生成能力有负面影响[18]。

2.3 基质胶提取制备的方法

基质胶的提取制备，一般是将EHS 肿瘤组织匀浆，用盐溶液反复洗去可溶性蛋白成分，然后利用高浓度的中性盐溶液（例如，胍盐、尿素和硫酸铵溶液）沉淀提取不溶性蛋白成分，并进行透析纯化获得[13-14,19]，提取的基质胶呈无色液体状态。由于基质胶在胶化后则不能恢复到液体形态，所以在其提取制备过程中必须要保持在4℃左右的环境，而且所有接触基质胶的移液管和注射器等器材也需要事先经过低温预冷处理。另一方面，基质胶提取制备步骤的时间太长时，其活性会丢失，这要求其整个的分离和透析时间最好在4 d以内完成。由于基质胶浓度过低时不能形成固体状态，提取制备的基质胶蛋白浓度不应低于9 mg/mL，浓度较低的基质胶提取物可以使用40%硫酸铵溶液进行沉淀，然后再用较小体积的溶液重悬和透析。一般来说，1 g肿瘤组织可以制备1.5 mL左右的基质胶产品。若要降低基质胶中的生长因子含量，在利用中性盐溶液沉淀后，可以对获得的不溶性蛋白再次利用20%氯化钠溶液沉淀[20]。

3 基质胶的主要用途

3.1 细胞分化实验

基质胶能够促进多种不同类型细胞的分化，甚至一些细胞系和原代细胞，在接触到基质胶时会在不增殖的情况下分化[21-23]。该实验中细胞一般接种在基质胶的表面，但也可以在其凝胶化之前与细胞混合接种，通过观察细胞形态和分析其基因表达可更好地反映细胞的分化状态。诸如睾丸支持细胞等上皮细胞在胶顶部生长时多呈现柱状，而当混在基质内部时形成腺体样结构，无论在哪种培养条件下，睾丸支持细胞的分化程度都比生长在塑料基底上高[24]。基质胶上的分化反应依赖于细胞类型，细胞在基质表面或内部通常呈三维联系，进而形成与其在来源组织内相似的结构。例如，上皮细胞形成管状和腺体样结构[25]，而软骨细胞则在基质表面形成软骨结节[26]。原代细胞和细胞系在基质胶上均可呈现分化表型，如永生化的微血管内皮细胞和人脐静脉内皮细胞均形成几乎一样的毛细血管样结构[20]。

3.2 内皮细胞成管实验

内皮细胞是第一种表现出形态分化的细胞种类，一旦将其接种于胶化的基质胶，它们将在1 h内黏附，并在随后数小时内相互迁移，形成带有内腔的管状，最后在12 h内成为细胞与细胞、细胞与基质紧密连接的状态，而转化细胞则可在约一半的时间内完成上述过程[27-28]。这种形态分化为评价血管生成的许多方面及治疗测试提供了强有力的实验方法。该实验模拟了血管生成的多个步骤，包括细胞黏附、迁移、蛋白酶分泌和管状形成[29]，管状结构可摄入低密度脂蛋白。此方法不仅可以模拟体内血管生成过程，而且有高度可重复性、可量化、易操作和适于高通量筛选的特点，所以可用于筛选血管生成和抗血管生成因子、鉴定血管生成信号通路、鉴定血管生成中基因的上调和下调、鉴定内皮祖细胞、内皮与肿瘤细胞相互作用等。

3.3 细胞侵袭实验

细胞侵袭是指细胞分泌金属蛋白酶消化细胞外基质，向其他区域或组织迁移的过程，是正常细胞或肿瘤细胞应对化学和机械刺激的反应能力，对伤口修复、血管形成、炎症反应、组织异常浸润和肿瘤转移等至关重要[30]。当前，侵袭实验多在Transwell培养板或Boyden小室等中进行[31]，在上室的微孔滤膜上铺一层基质胶后接种细胞，下层小室中可置入诱导剂，一定时间后收集下室中的细胞，进行定量计数或功能分析。此实验可用于评价细胞的侵袭能力、分选高侵袭能力的细胞、研究介导细胞侵袭的机制、筛选对细胞侵袭具有调控作用的药物成分等；在多种细胞共存时也可以研究细胞的相互作用，可将2种以上的细胞都放入上室，或者上、下室中分别接种不同种类的细胞。细胞迁移实验与侵袭实验操作类似，二者不同之处在于，前者主要评价细胞的迁移能力，其上层小室的微孔膜一般不包被基质胶[32]。

3.4 类器官培养

类器官(Organoid)是利用胚胎或成体干细胞等进行体外三维培养，形成具有一定空间结构及功能的类似器官的细胞团[33]。相比于传统二维细胞培养，类器官能够使得细胞之间进行复杂的交互，更好地体现了体内细胞间作用和微环境状态，为生物医学相关研究提供了强大工具，是近十年来生命科学领域发展最为迅速的前沿性科学技术之一，类器官技术已经广泛应用在组织发育、疾病模型、药效评估、器官移植和再生医学等领域[34-35]。基质胶是类器官培养中最常用的关键基质，是促进类器官正常生长的关键生物材料，由于与干细胞及其形成的类器官有良好相容性，且能提供必需的信号转导细胞因子和结构性细胞外基质蛋白，使其中的细胞可以在三维空间聚集、增殖、分化并自组装，在类器官培养中发挥着不可或缺的作用[36]。尤其对于肿瘤类器官，肿瘤组织来源的基质胶更适于其生长，用于肿瘤类器官培养和功能评价具有天然优势[37]。有研究表明，用肿瘤类器官进行化疗药敏测试的结果指导临床用药，药敏结果对患者的敏感性达100%，特异性达93%[38]，彻底改写了肿瘤精准治疗的理念。

3.5 填塞物血管生成实验

填塞物血管生成实验是一种广泛用来评价体内血管生成的简单方法，可以确定局部或全身性血管生成刺激因子和抑制因子、肿瘤细胞的血管生成活性、宿主源性因子的作用等[39-40]。实验一般用C57BL/6小鼠，将300～500 μL基质胶注射在其背部或腹股沟处皮下，检测促血管新生因子时使用减生长因子基质胶，而检测抗血管新生因子时用正常或添加活性因子的基质胶。填塞后5～7 d 对基质胶填塞物，采用免疫组化方法检测血管标志分子，或注射荧光标记葡聚糖后检测其中荧光素，或采用Drabkin试剂盒检测血红蛋白，或采用PCR方法检测内皮和炎症相关基因的表达。

3.6 异种移植

肿瘤生物学及其治疗方法研究中，对动物模型的需求强烈，基质胶可用于提高癌症细胞、癌症干细胞和非癌症细胞的生长。简单做法是，将肿瘤细胞与基质胶混合后直接注射。肿瘤的生长速度和收取量取决于基质胶的浓度、肿瘤细胞类型和数量、注射部位、其他类型细胞的有无以及受体动物的种类。例如，MCF-7细胞直接注射到小鼠体内不成瘤，而与基质胶混合后可在皮下形成肿瘤[41]；B16F10细胞单独注射到小鼠体内成瘤率极低，使用基质胶后成瘤率显著增加[42]。将基质胶作为肿瘤细胞载体移植时，作用机制与其促进血管生成和阻止肿瘤细胞的失巢凋亡有关[43]。因此，在移植肿瘤细胞时加入基质胶能加速实验进程，可以节约经费和时间。

3.7 其他应用

除了前述几种体内外实验的应用外，基质胶的新用途还在不断地被开发。例如，由于基质胶可促进细胞分化为腺体腺泡、骨小管和髓鞘等功能性结构，故也许可利用体外在基质胶诱导分化细胞替代或支持体内组织功能，已有利用基质胶培养的胰腺腺泡细胞移植到糖尿病小鼠体内，维持了数天的血糖降低[44]；鉴于基质胶在血管生成、细胞分化或组织转化方面作用，可将其用于促进伤口愈合或组织修复，一些初步研究已表现出基质胶修复心脏和肠道组织的希望[44]。

4 总结与展望

基质胶因其特殊的生物学特性体现了在生命科学研究中的重要价值，尤其随着类器官培养等前沿技术的快速发展，及其潜在应用的不断开发，已成为当前生命科学研究领域最为紧俏的生物材料之一。本研究综述了基质胶的生物组织来源、最主要来源组织EHS肿瘤模型的复制方法、提取制备方法及主要用途等，为基质胶的实验应用及中国高质量基质胶产品的开发提供了有价值的参考。

基质胶虽然为细胞的三维培养和类器官生成提供了必需的物理支持，但不可否认的是，仅靠基质胶构成的微环境无法实现类器官的生长发育，还需要多种细胞因子、营养素的关键作用[45]。为了更好地模拟在体基底膜细胞外基质的生物学特性，需要在以基质胶为基础的培养基中添加细胞因子或基质蛋白质，构建具有组织器官特异性的特定基质胶产品。尽管当前对组成成分完全明确的标准化基质胶体系构建仍存在困难，但必将是未来基质胶产品发展的方向之一。另一方面，类器官的生长大小和均一性受到基质胶所构筑空间结构的限制[46-48]，为了调控类器官生长分化的大小和密度，对基质胶构筑微孔的形状和大小进行控制也非常必要，这也是未来提高基质胶产品质量和针对性的重要发展方向之一。