鼠性成熟前期睾丸扭转对性成熟期健侧睾丸C-kit、PI3K表达的影响研究

李刚龙 马洪 林金凤 赵鹏 刘红 杨远贵 陈进

(1.遵义医科大学附属医院小儿外科,贵州 遵义 563003;2.广东省妇幼保健院,广东 广州 510010;3.贵州省人民医院,贵州 贵阳 550002)

睾丸扭转也称精索扭转,是泌尿外科常见的阴囊急诊,可发生在各个年龄阶段,但以小儿和青少年多见,可影响成年后男性的生殖功能[1]。睾丸扭转后精索内的动静脉血液循环产生障碍,从而出现睾丸缺血,细胞发生凋亡坏死等组织病理学改变[2]。国内外学者对儿童期睾丸扭转的研究、大多集中在短期内患侧睾丸方面,如扭转睾丸的病理、病理生理以及分子生物学等改变[3]。儿童期睾丸扭转后,对成年期健侧睾丸生精功能的影响鲜有报道。目前一侧睾丸扭转,对侧睾丸是否受损仍存争议。文献[4-5]报道睾丸精原干细胞因子受体(C-kit)、磷酯酰肌醇-3-激酶(PI3K)在睾丸生殖细胞增殖及凋亡中发挥重要调节作用,机制可能是SCF/C-kit系统激活PI3K→AKT→mTOR→P70S6K→CyclinD3→Rb p42/p94完成细胞DNA合成信号传递,调控生殖细胞增殖分化。鉴于C-kit、PI3K在生殖细胞增殖、分化及凋亡中的调控作用,本研究制作性成熟前期睾丸扭转的动物模型,待性成熟期后检查健侧睾丸生精上皮C-kit、PI3K的表达水平,用以初步判定健侧睾丸的生精功能是否受到损害。

1 材料与方法

1.1 材料选用SPF级3周龄雄性SD鼠,体重(85±15)g,由陆军军医大学实验动物中心提供,许可证号:SCXK(渝)2012-0005。实验动物56只,随机分成7组,每组8只。实验动物放在带有气温控制和光线调节的环境内饲养,温度(21±2)℃,湿度(50±20)%,并可以自由觅食、饮水。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型制作本篇论文与《贵州医药》2023年1月第47卷第1期发表的论文《幼鼠睾丸扭转对成年期健侧睾丸及性激素的影响》的研究系同一批动物,动物模型制作、扭转睾丸处于不同状态判定标准、以及动物术后的处理、不同状态的扭转睾丸图片见已发表的论文[6]。本课题组前期发表论文已成功制作鼠睾丸扭转动物模型[6]:即对照组(CG)、扭转未坏死睾丸复位组(NNTR)/切除组(NNTO)、扭转疑似坏死睾丸复位组(SNTR)/切除组(SNTO)和扭转坏死睾丸复位组(NTR)/切除组(NTO)。

1.2.2 SP免疫组化检测C-kit及PI3K的表达术后饲养6周至性成熟期、脱颈法处死大鼠,切取健侧睾丸做成石蜡标本,连续切片3～5 μm,应用免疫组化SP法检测C-kit、PI3K的表达。(1)检测方法:石蜡切片常规脱蜡至水,3%过氧化氢浸泡10 min,消除内源性过氧化氢酶活性;在微波炉中进行抗原修复,滴加山羊血清封闭液,滴加一抗(稀释度为1∶300),37 ℃恒温箱中复温30 min;滴加二抗,DAB显色液进行显色,苏木素复染,自来水冲洗后1%盐酸酒精分化,脱水、透明、封片。(2)结果判断:光学显微镜下精原细胞胞膜或胞浆呈现棕黄色颗粒为阳性,采用Image-pro plus 6.0图像采集系统进行图像分析,每张切片随机选取3个互不重复交叉的视野(×400),检测各切片生精细胞C-kit、PI3K的积分光密度(IOD),IOD值越大表示阳性表达越强,C-kit、PI3K含量越高。

2 结 果

2.1 性成熟期健侧睾丸组织C-kit、PI3K的表达CG组PBS代一抗空白对照,各级生精细胞、间质细胞均无C-kit阳性表达(图1);CG组睾丸组织C-kit蛋白在各级生精细胞、间质细胞的胞膜与胞浆呈阳性表达(图2)。NNTR和NNTO组:各级生精细胞、间质细胞的胞膜及胞浆C-kit蛋白表达丰富(图3～4)。SNTR和SNTO组:生精细胞、间质细胞的胞膜及胞浆呈黄褐色,C-kit阳性表达(图5～6)。NTR和NTO组:前者生精细胞、间质细胞的胞膜及胞浆呈弱阳性表达(图7),后者生精细胞、间质细胞的胞膜及胞浆呈深染黄褐色,C-kit蛋白表达富集(图8)。PI3K在各组中的表达与C-kit一致,不同之处在于PI3K只在胞浆表达、包膜无表达(图9～16)。

图1 CG组,PBS代一抗,曲细精管精原细胞、间质细胞无C-kit表达(×400)

图2 CG组,曲细精管精原细胞、间质细胞C-kit表达富集(×400)

图5 SNTR组,C-kit在精原细胞、间质细胞的胞膜、胞浆阳性表达(×400)

图6 SNTO组,C-kit在精原细胞、间质细胞的胞膜、胞浆阳性表达(×400)

图7 NTR组,C-kit在精原细胞、间质细胞的胞膜、胞浆弱阳性表达(×400)

图8 NTO组,C-kit在精原细胞、间质细胞的胞膜、胞浆强阳性表达(×400)

图9 CG组,PBS代一抗,曲细精管精原细胞、间质细胞无PI3K表达(×400)

图10 CG组,曲细精管精原细胞、间质细胞的胞浆PI3K表达富裕(×400)

图11 NNTR组,PI3K在精原细胞、间质细胞的胞浆表达丰富(X400)

图12 NNTO组,PI3K在精原细胞、间质细胞的胞浆表达丰富(X400)

图13 SNTR组,PI3K在精原细胞、间质细胞的胞浆阳性表达(×400)

图14 SNTO组,PI3K在精原细胞、间质细胞的胞浆阳性表达(×400)

图15 NTR组,PI3K在精原细胞、间质细胞的胞浆弱阳性表达(×400)

图16 NTO组,PI3K在精原细胞、间质细胞的胞浆表达富集(×400)

2.2 性成熟期健侧睾丸组织C-kit、PI3K表达的IOD值采用Image-pro plus 6.0软件分析各组睾丸生精细胞和间质细胞C-kit、PI3K的IOD值。C-kit、PI3K分别在NNTR与NNTO组间比较、以及SNTR与SNTO组间比较,差异均无统计学意义(P>0.05);但NTR与NTO组间比较,NTO组C-kit、PI3K的IOD值明显高于NTR(P<0.05)。与假手术对照CG组C-kit、PI3K的IOD值比较,NNTR、NNTO以及NTO组间均无统计学差异(P>0.05);与假手术对照CG组比较,SNTR、SNTO以及NTR组C-kit、PI3K的IOD值均显著降低(P<0.05)。见表1

表1 各组C-kit、PI3K的IOD值比较

3 讨 论

睾丸扭转在小儿和青少年中常见,睾丸扭转后需手术探查,且依据术中情况决定睾丸的取舍,但在临床实践中,一些疑似坏死的睾丸在未进行病理活检的情况下,很难判断睾丸的生机,而且患儿家属大多不能接受切除睾丸。有文献[7]报道,单侧睾丸扭转后,健侧睾丸大多会受到不同程度的影响。Z.Xia等[8]通过鼠动物实验发现一侧睾丸发生扭转坏死后,对侧睾丸、附睾及输精管均受到一定程度损伤。刘子明等[9]研究发现实验性的睾丸扭转诱导对侧睾丸组织受损,表现为曲细精管萎缩,生殖细胞脱落于管腔,生精细胞发生凋亡,体液免疫和细胞免疫可能参与了这一过程。然而,也有学者通过一系列研究[10]发现,青春前期一侧睾丸扭转后,对侧睾丸生精功能并未受到明显影响。H.Ahmadnia等[11]研究表明睾丸扭转不会引起对侧睾丸的长期损害,多为一过性损害,为保护对侧睾丸受损伤而行扭转侧睾丸切除并不必要。上述研究,有的扭转睾丸已坏死,有的扭转睾丸未坏死,有的是睾丸扭转后短期观察,有的是长期观察。因此,有必要对处于不同状态的扭转睾丸(扭转未坏死、扭转疑似坏死、扭转坏死),做一全面系统的研究。

干细胞因子SCF/C-kit系统通过PI3K信号通路:PI3K→AKT→mTOR→P70S6K→CyclinD3→Rb p42/p94完成细胞DNA合成信号的传递,介导精原细胞增殖[12]。与此同时,相关研究[13]还表明,在多种细胞系的增殖体系中PI3K/AKT途径是细胞存活并分化的主要途径,C-kit/PI3K/AKT细胞信号途径的正常表达对精原细胞增殖、分化具有不可替代的作用。本研究结果显示,性成熟前期扭转未坏死睾丸无论复位抑或切除,以及扭转坏死睾丸切除,对性成熟期健侧睾丸无损害;而扭转疑似坏死睾丸不论复位、还是切除,以及扭转坏死睾丸复位,对健侧睾丸均有损害,致使C-kit、PI3K在生精细胞、间质细胞的胞膜及胞浆中表达降低。进一步研究表明扭转坏死的睾丸切除,对健侧睾丸有保护作用,其原因可能是睾丸发生扭转后,一方面睾丸的血睾屏障被破坏,产生的抗精子抗体逸出,引起自身免疫反应,杀伤生精细胞;另一方面,由于睾丸扭转后产生缺血再灌注损伤,机体抵御过氧化物损伤的关键保护因子如核因子E2相关因子(Nrf2)表达减弱,加重生精细胞损伤[14]。从而出现C-kit蛋白表达降低,进一步通过SCF/C-kit通路影响PI3K的表达,导致SNTR、SNTO以及NTR组中C-kit、PI3K表达均降低。

综上所述,鼠性成熟前期扭转未坏死睾丸的复位与切除,对性成熟期健侧睾丸无损伤;扭转疑似坏死睾丸无论切除与复位,对性成熟期健侧睾丸均有轻微损害,应予以保留;扭转坏死睾丸的切除,对性成熟期健侧睾丸具有保护作用,应尽可能切除。

利益冲突说明/Conflict of Intetests

所有作者声明不存在利益冲突。

伦理批准及知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究通过遵义医科大学附属医院医学伦理委员会批准,动物实验不涉及知情同意。