外周血CD8+效应记忆T细胞对脓毒症诊断的价值评估

陈国昇,文大林,种慧敏,张 鹏,杜 娟,杨 堃,张可珺,邓 进,张安强

1.安顺市人民医院泌尿外科,贵州 安顺 561000; 2.陆军军医大学大坪医院,创伤与化学中毒全国重点实验室,重庆 400042; 3.贵州医科大学附属医院急诊科,贵阳 550004; 4.陆军军医大学大坪医院检验科,重庆 400042; 5.重庆市渝北区中医院重症医学科,重庆 401121

脓毒症被定义为因宿主对感染反应失调导致的危及生命器官功能障碍[1]。最近的一份全球疾病负担报告强调,全球每年有将近5 000万人发生脓毒症[2]。目前认为在脓毒症的发生及发展过程中同时存在不平衡的过度炎症和免疫抑制,而大多数患者的预后不良与严重的免疫抑制有关[3]。脓毒症患者的免疫抑制涉及不同的细胞类型和特征,与免疫细胞凋亡增强、T细胞衰竭、通过表观遗传变化使细胞重编程、激活细胞表面分子的表达减少等有关[4]。Pauken和Wherry[5]研究表明T淋巴细胞耗竭是脓毒症患者发生免疫抑制的主要特征。因此早期动态检测脓毒症患者T细胞亚群的变化,监测和评估脓毒症患者的免疫功能状态,及时诊断和评估患者病情严重程度,对患者进行风险分层,有利于及时采取措施以改善脓毒症的预后。

CD8+T淋巴细胞具有细胞毒性作用,可杀灭靶细胞及带有特异性抗原的细胞,促进抗体合成及T淋巴细胞增殖过程,是人体体液免疫与细胞免疫的重要调节者,对于保持内环境稳态具有重要作用[6],并且CD8+记忆T细胞亚群在对抗脓毒症患者二次感染中发挥重要作用[7]。虽然在脓毒症的临床与基础研究中对CD8+T细胞的研究较多,但是对CD8+T细胞亚群在脓毒症中的作用研究较少。因为从脓毒症发生开始,便同时存在免疫功能亢进及免疫抑制[3],因此本研究的观察时间点选择在患者因脓毒症入ICU第1、3、5天,并通过检测危重症患者外周血CD8+T细胞亚群的变化,评估其用于脓毒症诊断的价值。

资料与方法

1 一般资料

纳入标准:(1)年龄≥18岁入住ICU;(2)脓毒症的诊断基于Sepsis-3标准[1]。排除标准:(1)患有自身免疫性疾病、肿瘤或免疫缺陷;(2)患有艾滋病毒、肝炎和梅毒等传染病;(3)孕妇和哺乳期。

前瞻性选择2021年3月—2022年3月陆军军医大学大坪医院ICU收治的符合纳入排除标准的脓毒症和非脓毒症各30例患者作为研究对象。其中男性40例,女性20例;年龄29～70岁,平均55.4岁。其中创伤患者16例(道路交通伤7例,高处坠落伤5例,挤压伤3例,锐器伤1例)。脓毒症患者感染来源:肺部感染7例、腹部感染11例、血液感染3例、泌尿系感染6例、其他感染3例。患者分类见表1。本研究已通过陆军军医大学大坪医院医学伦理委员会批准(2019-137)。

表1 两组患者疾病分类(n)

2 研究方法

本研究样本采集自陆军军医大学大坪医院ICU,由安顺市人民医院、贵州医科大学和陆军军医大学大坪医院的研究人员完成指标检测、数据收集和分析。从临床电子医疗系统收集患者临床资料,包括患者原发疾病以及基本信息、感染部位、常规实验室检测指标以及现有临床状态和疾病严重程度并进行分析。患者疾病严重程度由APACHE Ⅱ评分和序贯器官衰竭评分(sequential organ failure assessment,SOFA)进行评估。使用流式细胞仪检测患者入ICU第1、3、5天CD8+T细胞各亚群比例,收集血浆降钙素原(procalcitonin,PCT)、CRP及IL-6的临床化验结果,并分析上述指标在各组间的差异、与脓毒症发生的关系、各指标对脓毒症的诊断效能以及与脓毒症严重程度的相关性。

2.1样本采集 对符合纳入标准的危重症患者,以连续采血的方式,分别于入ICU后第1、3、5天用乙二胺四乙酸二钠(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt,EDTA-2Na)抗凝真空管采集外周全血2 mL,混匀后室温放置待用。

2.2CD8+T细胞亚群比例的检测 各细胞免疫指标选择不同荧光直接标记的抗体(美国Beckman Coulter公司)与对应指标分子特异性结合,通过Navios多通道流式细胞分析仪(美国Beckman Coulter公司)检测患者外周血细胞CD45、CD3、CD4、CD8、CD45RA、CD197表达水平,所有血液样本在采集后2 h内完成检测。使用Kaluza流式分析软件分析 CD3+T淋巴细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞及其亚群的比例,主要有初始CD8+T细胞、效应记忆CD8+T淋巴细胞、中央记忆CD8+T淋巴细胞。比较上述各细胞亚群在患者入ICU第1、3、5天的变化规律,分析其在脓毒症与非脓毒症患者中的表达差异,研究其与脓毒症严重程度的相关性。

3 统计学分析

结 果

1 危重症患者基线资料以及脓毒症患者与非脓毒症患者PCT、CRP及IL-6水平比较

脓毒症患者入ICU第3天的SOFA显著高于非脓毒症患者(P=0.048),第1天及第5天比较差异均无统计学意义(P>0.05)。APACHE Ⅱ评分在第1、3、5天比较差异均无统计学意义(P>0.05),组别、时间主效应以及组别与时间交互效应均不显著(P>0.05)。脓毒症患者入ICU第1、3、5天的PCT及第1天CRP水平明显高于非脓毒症患者(P均<0.05),第3天及第5天CRP差异无统计学意义(P>0.05)。第1、3、5天IL-6比较差异均无统计学意义(P>0.05),其中CRP组别主效应显著(P=0.034),PCT组别、时间主效应以及组别与时间交互效应均显著(P<0.05)。见表2。

表2 两组患者基线资料比较

2 脓毒症患者与非脓毒症患者T细胞及CD8+T细胞亚群的变化

入ICU第1、3、5天脓毒症患者的CD3+T细胞比例、CD8+效应记忆T细胞(TEM)比例显著低于非脓毒症患者(P均<0.05);第3天CD4+T细胞亚群比例以及CD8+Naive T细胞比例显著高于非脓毒症患者(P均<0.05),余指标在两组间差异均无统计学意义(P均>0.05)。其中CD3+T细胞比例组别主效应显著(P<0.001),CD4+T细胞比例时间主效应显著(P=0.022),CD8+TEM细胞比例组别主效应显著(P<0.001),CD8+Naive T细胞比例组别主效应显著(P=0.020)。见表3。

表3 脓毒症患者CD8T细胞亚群表达变化

3 危重症患者发生脓毒症的危险因素分析

建立Logistic回归模型,以发生脓毒症为因变量,以性别和年龄作为校正因素,进行单因素Logistic回归分析,结果显示,入ICU第1天CD3+T细胞亚群比例、CD8+TEM比例、PCT以及CRP均与脓毒症发生显著相关(P均<0.05)。见表4。将上述4个指标纳入多因素逻辑回归分析,结果显示CD8+TEM比例以及CRP为脓毒症发生的独立危险因素(P均<0.05)。见表5。

表4 单因素Logisitic 回归分析患者入ICU第1天发生脓毒症的危险因素

表5 多因素Logisitic 回归分析患者入ICU第1天发生脓毒症的危险因素

4 脓毒症诊断效能分析

在脓毒症诊断中CRP、CD3+T细胞、CD8+TEM及PCT的AUC(95%CI)分别为:0.772(0.646～0.871)、0.737(0.608～0.842)、0.795(0.665～0.892)、0.851(0.736～0.930),后两者联合诊断脓毒症的AUC为0.890(0.775～0.959)。见图1。

PCT:降钙素原;CD8+TEM:CD8效应记忆T细胞

讨 论

脓毒症的特征是对全身感染的过度免疫反应,导致炎症失控、血管功能障碍、急性淋巴细胞减少和长期免疫麻痹。因此早期监测脓毒症患者免疫功能,判断患者免疫抑制状态,准确评估患者病情,及时做出诊断,以指导临床治疗,对改善脓毒症患者预后至关重要。而生物标志物的应用有效增加了脓毒症诊断及预测的准确性。为此笔者检测了脓毒症发生发展过程中免疫细胞亚群的改变,尤其是T细胞亚群的动态变化,来探寻对脓毒症的诊断以及患者病情评估的新的高敏感性及特异性指标。

研究证实,脓毒症患者免疫抑制的主要特征是T细胞耗竭,其表现为T细胞增殖降低、细胞因子分泌能力下降且易于凋亡[5,8]。在脓毒症患者中,由于发生免疫稳态失衡,尤其是淋巴细胞持续减少的患者,其病死率显著高于其他患者,使得淋巴细胞绝对值减少成为评估持续免疫抑制及不良预后的重要指标[9]。在本研究中,脓毒症患者在入ICU第1、3、5天的T细胞比例均显著低于非脓毒症患者(P均<0.05),提示脓毒症患者处于严重的免疫抑制状态。Logistic回归分析显示T细胞的降低与脓毒症的发生显著相关,其对脓毒症的诊断的AUC为0.737(0.608～0.842),有较好的效能。所以了解T细胞在患者发生脓毒症之后的变化,可以更加全面地了解脓毒症患者的免疫状态,更有效地指导临床特异性的治疗。

在感染发生后,抗原被免疫系统识别,初始T细胞迅速分化为效应T细胞,大多数效应T细胞迁移至感染部位来对抗病原体[10]。而在感染清除后大部分效应T细胞发生死亡,有一部分分化为记忆T细胞[11]。记忆T细胞被分为两群即TCM和TEM,前者在宿主体内存活的时间较长,但在病原体再次感染时,后者能更迅速地发挥作用[12]。记忆性CD8+T细胞群一旦形成,就可以维持到宿主的整个生命周期,这些细胞提供了对细胞内感染的保护,并介导抗肿瘤免疫[13],并且其部分亚群与脓毒症的严重程度显著相关[14]。在本研究中,笔者主要发现CD8+TEM在第1、3、5天的比例显著低于非脓毒症患者(P均<0.05)。Logistic回归分析显示CD8+TEM细胞比例降低与脓毒症发生显著相关,其对脓毒症诊断的AUC为0.795(0.665～0.892),有较好的效能,因此CD8+TEM细胞亚群的比例可以作为脓毒症诊断的一个新指标,以期为脓毒症患者的诊疗提供有用的帮助。

CRP和PCT均是机体应对感染和损伤时产生的蛋白质,后者在临床上被用作最常用的感染诊断指标,尤其是在患者发生脓毒症后迅速升高,对脓毒症的诊断及预后预测有一定的价值[15]。在本研究中,PCT在脓毒症患者中的表达显著升高,其对脓毒症的诊断效能为0.851(0.736～0.930),其与CD8+TEM细胞亚群联合后,对脓毒症的诊断效能显著提高,AUC为0.890(0.775～0.959),明显高于其他单个指标。

综上所述,本研究发现CD8+TEM细胞亚群可以作为脓毒症诊断、评估患者免疫功能以及判断疾病严重程度的新指标。但是本研究也存在几点不足之处:(1)单中心小样本量研究,限制了普遍性;(2)虽然动态地研究了T细胞亚群,但是没有继续进行远期监测。希望本次研究结果能在更大的队列研究中进行验证,以期为脓毒症的临床诊疗提供支持。

作者贡献声明：陈国昇:论文撰写、数据分析、资料采集;文大林、种慧敏:实施研究、资料采集;张鹏、杜娟:分析数据;杨堃、张可珺:技术支持;邓进:设计实验;张安强:设计实验、获取研究经费、文章修改