岩白菜素对大鼠心肌细胞的缺氧/复氧损伤保护作用的机制研究

杜艳梅，田展松，谭延振，孙 阳

心肌缺血-再灌注损伤（myocardial ischemiareperfusion, MI/R）是指心肌短暂缺血后，冠状动脉再次开放造成的心肌细胞损伤[1]。我国急性心肌梗死死亡率呈逐年升高趋势，再灌注治疗能够挽救濒死的心肌细胞，保护心脏功能，是临床有效的治疗策略[2]。然而再灌注治疗也有可能造成心脏损伤。MI/R 被证实是一种复杂的病理生理过程，其涉及氧化应激、炎症反应、自噬、铁死亡等多个方面。其中氧化应激能够改变心肌细胞代谢状态，增加心肌凋亡和坏死，降低心肌收缩力，导致心脏功能不全[3]。有研究指出，活性氧（reactive oxygen species, ROS）过量产生引起的氧化应激在MI/R 机制中起到重要作用[4]。因此，研究氧化应激和ROS 产生可能是治疗MI/R 潜在方法。

近年来，多种植物来源的中药成分已经被证明能够治疗心血管系统相关疾病。其中，岩白菜素（bergenin, Ber）又称岩白菜内酯、紫金牛酸B、矮茶素等，是一种天然的次生代谢产物，广泛存在于多种植物的各个部位[5]。据报道，Ber 具有多种药理学活性，如抗炎、抗氧化、抗疟疾和免疫调节等[6]。近年来对Ber 抗氧化作用的研究越来越多。沉默交配型信息调控2 同源物1（silent mating type information regulation 2 homolog-1,SIRT1）属去乙酰化酶Sirtuin 蛋白家族，是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性的组蛋白去乙酰化酶，广泛参与细胞内蛋白质去乙酰化。有研究表明，SIRT1能够去乙酰化修饰下游蛋白调节细胞代谢，抑制氧化应激[7]。SIRT1 能抑制还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH）氧化酶的活性，减少细胞内ROS 的产生，从而保护血管内皮功能，减少动脉粥样硬化斑块的产生[8]。SIRT1 能够显著抑制氧化应激过程，减轻局部炎症反应。过氧化物酶体增殖物受体共激活因子-1α（peroxisome proliferator activate d receptorγcoactivator-la, PGC-1α）是一种细胞内重要的核受体转录激活因子，是线粒体能量代谢的重要调节因子[9]。SIRT1 还能通过去乙酰化修饰作用降低下游PGC-1α 的转录活性，进而抑制线粒体氧化反应的发生，减轻胰岛素抵抗。因此，SIRT1 在心血管疾病中可能作为抗炎、抗氧化和抗凋亡作用的重要靶点。团队前期研究结果表明，Ber 通过SIRT1 通路减少凋亡进而保护心肌细胞[10]。本研究旨在进一步探索Ber 对心肌损伤保护的分子机制。

1 材料与方法

1.1细胞培养和模拟缺氧/复氧（simulate ischemia/reperfusion, SI/R）损伤模型构建 大鼠心肌细胞（H9c2）购于天承生物科技有限公司（中国，上海）。大鼠心肌细胞（H9c2）使用添加10%胎牛血清和1%双抗（Hyclone，美国）的高糖培养基（dulbecco's modified eagle medium, DMEM）（Hyclone, 美国）在37℃、95%空气和5%CO2混合气体条件下培养。为了在体外环境中SI/R，大鼠心肌细胞先进行12 h 缺氧环境培养，而后进行2 h 常氧培养。缺氧培养时将上述DMEM 完全培养基替换为无血清和双抗的基础培养基。

1.2实验分组 心肌细胞分为SI/R+PBS 组、SI/R+Ber 组和SI/R+Ber+EX-527 组。SI/R+PBS 组使用磷酸缓冲液（phosphate buffer solution, PBS）干预作为对照组，SI/R+Ber 组加入含有100 μM 的Ber 培养基进行干预，SI/R+Ber+EX-527 组加入含有100 μM 的Ber 和50 nM EX-527 的培养基进行干预。为了验证SIRT1 下游通路，本实验采用了PGC-1α 抑制剂SR-18292（S8528，Selleck）抑制PGC-1α。实验分为3 组：SI/R+PBS 组、SI/R+Ber 组、SI/R+Ber+SR-18292 组。SI/R+PBS 组和SI/R+Ber 组处理同前述。SI/R+Ber+SR-18292组加入含有100 μM 的Ber 和10 μM SR-18292 的培养基干预。

1.3实验细胞活性噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）检测 96 孔板中每孔加入5×103细胞并分别加入PBS、Ber、Ber+PGC-1α 抑制剂（SR-18292）进行干预。按照MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（碧云天，中国）说明书配制5 mg/ml 的MTT 溶液备用，各组细胞干预后每孔加入10 μl MTT 溶液，置于细胞培养箱内孵育4 h。然后每孔加入100 μl 甲瓒溶解液，混匀后置于细胞培养箱内继续孵育，直至光镜下观察紫色结晶消失。随后在570 nm 处测定吸光度计算细胞活性。

1.4末端标记法（DNA terminal labeling, TUNEL）染色 为了检测Ber 对大鼠心肌细胞凋亡的保护作用，本研究使用TUNEL 染色检测大鼠心肌细胞发生凋亡的情况。各实验组进行细胞爬片后，加入PBS 清洗3 次后，加入4%多聚甲醛固定30 min，弃去液体后再加入TritonX-100 通透15 min。PBS 清洗后每张爬片加入80 μl TUNEL 反应混合液于爬片上，置于湿盒中37℃条件下反应1 h。再次PBS 清洗，加入DAPI（10 μg/ml）染液50 μl 染色5 min。PBS 清洗后置于共聚焦显微镜（Olympus FV100，日本）下观察并计数凋亡细胞。

1.5二氯荧光素（dichlorofluorescein, DCFH-DA）染色 2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯用来检测细胞内ROS 的产生。按照DCFH-DA 试剂盒说明书使用无血清培养基将DCFH 稀释为10 μmol/L 备用，弃去旧的细胞培养基，六孔板中每孔中加入1 ml稀释后的DCFH-DA 溶液，将细胞板置于细胞培养箱中孵育20 min，加入无血清培养基清洗3 次，充分洗去未进入细胞的DCFH-DA。置于共聚焦显微镜（Olympus FV100，日本）下观察并计算各组荧光强度。

1.6蛋白免疫印记（western blotting, WB）检测各组细胞弃去旧的培养基，每孔加入2 ml PBS 清洗3 次，用细胞刮将细胞刮下并收集于1.5 ml 离心管中。离心后加入200 μl 含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的细胞裂解液（康为世纪，中国），期间反复吹打使细胞裂解完全。充分离心后使用蛋白定量法试剂盒（碧云天，中国）检测蛋白液浓度。每管加入50 μl 蛋白上样缓冲液并混匀。水浴后进行WB 检测。经过上样、电泳、转印、封闭，使用B 淋巴细胞瘤-2 基因（B cell lymphoma-2，Bcl-2）（26593-1-AP，Proteintech）、Bcl-2 相关X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）（14796S，CST）、SIRT1（2496S，CST）、PGC-1α（ab191838，abcam）和磷酸甘油醛脱氢酶（reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase, GAPDH）（AT0002，Enibody）抗体在4℃条件下孵育过夜。洗膜缓冲液清洗后，孵育二抗。再次清洗后使用化学发光系统（Molecular Imager ChemiDoc ™ XRS+System; Bio-Rad Laboratories）进行曝光并记录相应蛋白条带情况。使用Image J 软件（v2.0.0）分析条带灰度值计算目的蛋白相对表达量。以GAPDH作为内参蛋白。

1.7乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase, LDH）释放和丙二醛（malondialdehyde, MDA）检测 各实验组干预后每孔加入辅酶I 和混合缓冲液，置于37℃条件下孵育15 min，随后加入2,4-二硝基苯肼并混合孵育15 min，再加入0.5 mol/L 氢氧化钠溶液室温下静置5 min，在450 nm 处测定吸光度计算LDH 活性。MDA 测定按照试剂盒说明书配制反应体系，离心管盖子表面插入针头，涡旋混匀后浸入95℃水浴中45 min 后流水冲洗降温。4 000 rpm 离心10 min 后在532 nm 处检测吸光度值。

1.8统计分析 本研究中数据使用SPSS 25.0 进行相关分析。符合正态分布资料以x±s 表示，比较实验组间差异使用方差分析和Bonferroni 事后多重检验。ns 表示无统计学差异，以P＜ 0.05 认为有统计学差异。

2 结果

2.1SIRT1 抑制剂减少Ber 导致的PGC-1α 表达量升高 WB 典型条带见图1A。统计结果表明，与SI/R+PBS 组相比，SI/R+Ber 组Bcl-2 的表达水平升高（P＜ 0.001）, 与SI/R+Ber 组相比，S I/R+B e r+E x-5 2 7 组B c l-2 的表达水平降低（P＜ 0.001）（图1B）；与SI/R+PBS 组相比，SI/R+Ber 组Bax 的表达水平显著降低（P＜ 0.001），与SI/R+Ber 组相比，SI/R+Ber+Ex-527 组Bax 的表达水平显著升高（P＜ 0.001）（图1C）；与SI/R+PBS 组相比，SI/R+Ber 组PGC-1α 的表达水平明显升高（P＜ 0.001），与SI/R+Ber 组相比，SI/R+Ber+Ex-527 组PGC-1α 的表达水平明显降低（P＜ 0.001）（图1D）。

图1 岩白菜素通过激活SIRT1 上调PGC-1α 并抑制心肌细胞凋亡

2.2PGC-1α 抑制剂降低Ber 的大鼠心肌保护作用 与SI/R+PBS 组相比，SI/R+Ber 组细胞活力显著升高（P＜ 0.001），而给予SR-18292 处理后，细胞活力显著降低（P＜ 0.01）（图2A）；与SI/R+PBS 组相比，SI/R+Ber 组LDH 释放显著降低（P＜ 0.001），而给予SR-18292 处理后，LDH 释放显著升高（P＜ 0.001）（图2B）；与SI/R+PBS组相比，MDA 生成明显减少（P＜ 0.01），而给予SR-18292 处理后，MDA 生成显著升高（P＜ 0.01）（图2C）。

图2 阻断岩白菜素保护大鼠心肌细胞凋亡并抑制脂质过氧化

2.3PGC-1α 抑制剂抑制Ber 减少大鼠心肌细胞凋亡 与SI/R+PBS 组相比，SI/R+Ber 组大鼠心肌细胞的凋亡指数明显降低（P＜ 0.01），而给予SR-18292 处理后，大鼠心肌细胞的凋亡指数明显升高（P＜ 0.01）。见图3。

2.4PGC-1α 抑制剂抑制Ber 减少大鼠心肌细胞的ROS 产生 与SI/R+PBS 组相比，SI/R+Ber组ROS 的产生显著减少（P＜ 0.05），而给予SR-18292 处理后，ROS 的产生明显升高（P＜ 0.01）（图4B）。

图4 PGC-1α 抑制剂逆转岩白菜素对心肌细胞氧化应激的保护作用

2.5PGC-1α 抑制剂减少抗凋亡分子和增加促凋亡分子的表达，但不影响SIRT1 的表达量 与SI/R+PBS 组相比，SI/R+Ber 组Bcl-2 表达水平呈倍数升高（P＜ 0.001），而给予SR-18292 处理后，Bcl-2 表达水平与SI/R+PBS 组无差别（P＜ 0.001）（图5B）； 与SI/R+PBS 组相比，SI/R+Ber 组Bax 表达水平降低（P＜ 0.01）, 而给予SR-18292处理后，Bax 表达水平明显升高（P＜ 0.05）（图5C）。与SI/R+PBS 组相比，SI/R+Ber 组SIRT1 表达水平和给予SR-18292 处理后，SIRT1 表达水平无明显变化（P＞ 0.05）（图5D）。

图5 SIRT1 激活下游PGC-1α 进而发挥抗凋亡作用

3 讨论

近年来，已经有报道证实植物提取物在保护心血管系统和改善心脏疾病预后方面的作用。Ber是一种天然的中药成分，存在于多种植物的不同部分。研究表明，Ber 具有抗炎、抗氧化、神经保护、免疫调节等作用。Li 等研究表明，Ber 能够抑制转化生长因子-b1 来减少氧化应激和细胞外基质累及，进而缓解博来霉素诱导的肺纤维化[11]。Yu 等的研究结果表明，Ber 能够作为抗氧化剂和免疫抑制剂，抑制糖尿病患者的高水平氧化应激，提高抗氧化酶水平，减少视网膜厚度，进而改善糖尿病患者视网膜病变[12]。以上结果提示Ber 能通过减少氧化应激发挥作用。Lei 等的研究指出，Ber 能够剂量依赖性地抑制NLRP3 炎性小体，减少白介素6、肿瘤坏死因子、白介素18 等细胞因子的释放，下调caspase 家族相关蛋白，提示了Ber 在抗炎、抗凋亡方面的作用[13]。然而，Ber 在MI/R 的病理进程中的分子研究尚显不足。研究团队前期研究发现Ber 对心肌细胞具有保护作用，其是通过SIRT1 信号通路改善心肌细胞凋亡和氧化损伤发挥作用。

SIRT1 是一种广泛存在于细胞的蛋白质去乙酰化酶，能够催化组蛋白的去乙酰化过程，进而参与多种生物学表现，如炎症、线粒体能量产生、机体衰老、凋亡和癌变等。SIRT1 已经被证实在多种氧化应激相关疾病中扮演重要角色。使用SIRT1特异性激动剂SIRT1720 能够抑制核转录因子-KB（nuclear factor-KB, NF-KB）信号转导，减少血管紧张素酶Ⅱ诱导的细胞因子释放，减少炎性细胞浸润，进而减少炎症和氧化损伤[14]。同样地，在细胞中过表达SIRT1 能够抑制还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶活性，减少ROS 生成和炎性因子表达。PGC-1α 被认为是SIRT1 下游的重要调节靶点。PGC-1α 是细胞内重要的核受体转录激活因子，能够调控下游多个基因的转录，其中包括ROS 的表达。因此，激活SIRT1/PGC-1α 通路理论上能够抑制ROS 的表达，从而减轻氧化应激损伤。心肌梗死是造成心肌细胞坏死的主要疾病，抗氧化、再灌注治疗是临床上广泛采用的治疗方案。然而，心肌在经历缺血损伤后，短时间内再灌注带来的细胞因子和炎性因子所导致的心肌细胞氧化应激损伤同样值得关注。

本研究证实了Ber 能够显著降低Bcl-2 水平增加Bax 的表达，并降低凋亡指数。此结果表明Ber 能够抑制大鼠心肌细胞凋亡。应用SIRT1 和PGC-1α 抑制剂能够分别抵消Ber 对大鼠心肌细胞的保护作用，表明Ber 通过影响SIRT1 和PGC-1α 水平进而影响大鼠心肌细胞凋亡。应用SIRT1抑制剂后，大鼠心肌细胞中PGC-1α 水平下降，提示SIRT1 能够上调下游PGC-1α 的表达。同样地，应用SIRT1 抑制剂后，低水平表达的PGC-1α 能够逆转Ber 的抗凋亡作用。这说明Ber 能够通过SIRT1/PGC-1α 通路保护大鼠心肌细胞免于凋亡。为进一步探究Ber 保护大鼠心肌细胞的作用机制，本研究进一步地检测了心肌细胞内ROS和LDH 的产生情况。Ber 干预组中，LDH 的释放显著降低，并减少MDA 的生成，PGC-1α 抑制剂能够逆转Ber 的抗氧化作用。这些结果提示PGC-1α介导了Ber对大鼠心肌细胞的保护作用，而Ber 减少氧化应激、保护大鼠心肌细胞是通过增加PGC-1α 水平，降低ROS 浓度发挥作用。因此本研究提出Ber 能够作为SI/R 治疗的潜在药物，通过揭示其作用机制，为此药走向临床奠定基础，同时为心肌梗死患者再灌注治疗后的心肌损伤提供更多临床治疗方案，以上结果表明，Ber具有潜在的治疗价值。