五指毛桃饮片的质量标准研究*

2024-04-22梁永娟韦礼校苏静红李锦清林青华

中医药导报 2024年3期

梁永娟，韦礼校，苏静红，李锦清，陈清，林青华,，蒋林,

（1.广西中医药大学药学院，广西南宁 530200；2.广西中医药大学广西壮瑶药工程技术研究中心，广西南宁 530200）

五指毛桃始载于清代何克谏所著的《生草药性备要》，时称之“五爪龙”[1]，今又名土黄芪、五指牛奶、土五加皮、母猪奶、南芪，主要产销于广东、广西，有“广东人参”的美誉[2-4]，是岭南地区常用的药食同源类中药[5-6]。五指毛桃为桑科植物粗叶榕Ficus hirta Vahl的干燥根，其味甘性平，归脾、肺、胃、大肠、肝经，具有健脾益气、行气利湿、舒筋活络的功效，用于治疗脾虚浮肿、食少无力、肺痨咳嗽、盗汗、带下、产后无乳、风湿痹痛、水肿、鼓胀、肝胆湿热、跌打损伤[7-8]。现代研究表明，五指毛桃主要含有苯丙素类、黄酮类、萜类、甾醇类、挥发油类等多种化学成分，具有保肝、提高免疫力、止咳祛痰、抗氧化、抗菌、抗炎等多种药理作用，广泛应用于治疗消化系统、循环系统、呼吸系统和生殖系统等多个系统疾病[9-10]。现已开发出的五指毛桃香鸡、五指毛桃果冻等多种食用产品[11]，极具药用、食用的开发价值。

中药饮片作为中医临床疗效的物质基础，是直接用于临床调配或制剂生产的原料药[12-13]。因此，中药饮片质量对于保障中医临床用药的有效性、安全性，推动中医药事业发展具有重要意义[14-15]。然而，五指毛桃饮片并未被2020年版《中华人民共和国药典》收载，现仅收载于广东[16]、福建[17]、湖南[18]的地方炮制规范中。现有的五指毛桃饮片质量标准并不完善，这不利于五指毛桃饮片的质量控制及进一步开发。此外，五指毛桃饮片质量标准研究方面的文献也未见报道，故本研究参照2020年版《中华人民共和国药典》（四部）和《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》[19]的相关规定，对不同产地的29批五指毛桃饮片进行研究，以期为完善五指毛桃饮片的质量标准提供参考和依据，同时也为五指毛桃配方颗粒及其相关制剂的研发奠定基础。

1 材料

1.1 仪器 Waters 2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Direct-Q5UV超纯水仪一体机（广西南宁博美生物科技有限公司）；MS105DU型电子分析天平（瑞士梅特勒托利多仪器有限公司）；DMB-1223型数显生物显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司）；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱（上海齐欣科学仪器有限公司）、SX2-4-10型马弗炉（沈阳市节能电炉厂）；硅胶板G板（青岛海洋化工有限公司）；HWS-28型恒温水浴锅（上海齐欣科学仪器有限公司）；KQ-500E超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 药品和试剂补骨脂素对照品（纯度＞98%，批号：RP220515）、佛手苷内酯对照品（纯度＞98%，批号：HR21513B1）均购于成都麦德生科技有限公司；色谱级甲醇[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；甲醇、正己烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲酸、磷酸等均为分析纯。

收集五指毛桃饮片共29批，经广西中医药大学药学院朱意麟教授鉴定为桑科植物粗叶榕Ficus hirta Vahl干燥根的加工品，样品信息具体见表1。

表1 五指毛桃饮片样品信息

2 方法与结果

2.1 外观性状鉴别本品呈类圆形或不规则的厚片，直径0.5~8.0 cm。表皮灰棕色至红褐色，细纵纹明显，可见横向皮孔。木部宽广，黄白色，密布同心性环纹，皮部薄而韧，易与木部相剥离。质硬而脆，断面纤维性，气微香，味微甘。（见图1）

图1 类圆形（A）及不规则形（B）的五指毛桃饮片

2.2 粉末显微鉴别本品粉末灰黄白色。石细胞散在或成群，直径16~45 μm，孔沟明显。草酸钙方晶散在，直径5~25 μm。淀粉粒众多，多为复粒（2～5分粒），脐点圆点形，层纹不明显，单粒呈类圆形或类椭圆形。木纤维多成束，壁厚。木栓细胞呈红棕色，壁较厚。导管多为具缘纹孔导管。（见图2）

图2 五指毛桃饮片的粉末显微图

2.3 薄层鉴别按2020年版《中华人民共和国药典》（四部）的薄层色谱法（通则0502）操作要求，取五指毛桃粉末（过2号筛）1 g，加乙醇15 mL，超声（功率500 W）处理40 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1 mL使溶解，即得供试品溶液。另取补骨脂素对照品，加乙醇制成每1 mL含1.03 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（体积比为20：0.4：0.5：0.7）为展开剂，展开，取出，晾干，喷10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰，分别于日光和紫外灯（365 nm）下检视。结果发现，供试品与对照品在薄层板相应位置上显相同颜色的荧光斑点，且斑点清晰，分离度良好，但不同批次样品斑点的大小及颜色的深浅略有不同。（见图3）

图3 五指毛桃饮片在日光下（A）和荧光下（B）的薄层色谱图

2.4 检查按照2020年版《中华人民共和国药典》（四部）的水分测定法（通则0832，烘干法）、灰分测定法（通则2302）、浸出物测定法（通则2201，热浸法），对29批五指毛桃饮片进行测定，具体结果见表2。

表2 五指毛桃饮片水分、总灰分、酸不溶性灰分和水溶性浸出物检测结果（n=2）

结果表明，29批五指毛桃饮片水分、总灰分、酸不容性灰分及水溶性浸出物的含量范围分别为5.67%~11.29%、1.90%~3.85%、0.06%~0.69%、5.71%~19.17%，其平均含量分别为8.02%、2.47%、0.23%和12.16%。按各检测项平均值波动20%的原则[20-21]，并综合考虑产地气候、生长环境、采收加工、炮制加工、存储条件等因素[22]的影响，拟定五指毛桃饮片的水分、总灰分和酸不溶性灰分分别不得超过12.0%、4.0%和0.7%，其水溶性浸出物不得低于6.0%。

2.5 含量测定

2.5.1 对照品溶液的制备取补骨脂素、佛手柑内酯适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含补骨脂素100.4 μg、佛手柑内酯50 μg的溶液，即得。

2.5.2 供试品溶液的制备取五指毛桃饮片粉末约0.5 g（过5号筛），精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理40 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足损失质量，摇匀，滤过，取续滤液5 mL水浴挥干，残渣加甲醇1 mL复溶，滤过，取续滤液，即得。

2.5.3 色谱条件色谱柱为UltimateRXB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以甲醇为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱（0~10 min，40%A~50%A；10~18 min，50%A~54%A；18~30 min，54%A~80%A；30~35 min，80%A~95%A；35~40 min，95%A）；柱温为30 ℃；流速为1 mL/min；检测波长为245 nm；进样量为20 μL。对照品及供试品的色谱图见图4。

图4 对照品溶液（A）和供试品溶液（B）的HPLC 图

2.5.4 方法学考察（1）线性关系的考察：精密取对照品溶液1、3、5、7、10 mL，分别置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，按“2.5.3”项下条件进样，记录峰面积。以对照品溶液浓度（X，μg/mL）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，求得补骨脂素的回归方程为Y=148 599X+61 866（R2=0.9 991），佛手柑内酯的回归方程为Y=71 096X+17 836（R2=0.9R997），表明补骨脂素与佛手柑内酯分别在10.04~100.40 μg/mL和5~50 μg/mL范围内线性关系良好。

（2）精密度试验：取五指毛桃饮片（WT15）的供试品溶液，按“2.5.3”项下条件连续进样6次，记录峰面积。求得补骨脂素、佛手柑内酯峰面积的RSD值分别为0.18%、0.08%，表明仪器精密度良好。（见表3）

表3 精密度试验考察结果

（3）重复性试验：称取五指毛桃饮片（WT15），按“2.5.2”项下方法平行制备供试品溶液6份，按“2.5.3”项下条件依次进样，记录峰面积。求得补骨脂素、佛手柑内酯峰面积的RSD值分别为2.08%、0.76%，表明该方法重复性良好。

（4）稳定性试验：取五指毛桃饮片（WT15）的供试品溶液，按“2.5.3”项下条件分别于0、2、8、12、18、24 h进样，记录峰面积。求得补骨脂素、佛手柑内酯峰面积的RSD值分别为0.73%、0.60%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

（5）加样回收率试验：称取已知补骨脂素、佛手柑内酯含量的五指毛桃饮片（WT15）9份，分别按补骨脂素、佛手柑内酯含量的80%、100%和120%加入相应对照品，按“2.5.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.5.3”项下条件进样，记录峰面积。求得补骨脂素、佛手柑内酯平均加样回收率分别为101.23%和98.72%，RSD值分别为1.78%和2.12%，说明该方法准确度良好。（见表4）

表4 五指毛桃饮片中补骨脂素、佛手柑内酯的加样回收率结果

2.5.5 样品测定按“2.5.2”项下方法制备各批次五指毛桃饮片的供试品溶液，按“2.5.3”项下条件分别进样，记录峰面积，按标准曲线法计算补骨脂素、佛手柑内酯的含量。结果表明，29批五指毛桃饮片中补骨脂素、佛手柑内酯的含量分别为0.01%~0.36%、0.01%~0.18%，平均含量分别为0.17%、0.05%。按平均含量下调20%的原则[20-21]，并在充分考虑中药指标性成分（有效成分）量值差异悬殊的基础上，拟定五指毛桃饮片中补骨脂素、佛手柑内酯的含量分别不得低于0.02%、0.01%。（见表5）

表5 五指毛桃饮片中补骨脂素和佛手柑内酯的含量测定结果（n=2）

2.6 特征图谱

2.6.1 对照品溶液的制备同“2.5.1”项下方法。

2.6.2 供试品溶液的制备同“2.5.2”项下方法。

2.6.3 色谱条件同“2.5.3”项下色谱条件。

2.6.4 方法学考察（1）精密度试验：按“2.5.2”项下方法制备五指毛桃饮片（WT15）的供试品溶液，按“2.5.3”项下条件分别连续进样6次，记录峰面积。以4号峰为参照，求得11个共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD值均＜3%，说明仪器的精密度良好。

（2）重复性试验：按“2.5.2”项下方法平行制备五指毛桃饮片（WT15）的供试品溶液6份，按“2.5.3”项下条件依次进样，记录峰面积。以4号峰为参照，求得11个共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD值均＜3%，说明该方法重复性良好。

（3）稳定性试验：按“2.5.2”项下方法制备五指毛桃饮片（WT15）的供试品溶液，按“2.5.3”项下条件分别于0、2、8、12、18、24 h进样，记录峰面积。以4号峰为参照，求得11个共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD值均＜3%，说明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.6.5 特征图谱的建立与共有峰的指认按“2.5.2”项下方法制备29批五指毛桃饮片的供试品溶液，按“2.5.3”项下条件进样，记录色谱图。将色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012年版）》，以WT15色谱图为参照，采用多点校正，以中位数法分别建立五指毛桃饮片的叠加图谱和对照图谱，共确定11个共有峰，通过与对照品溶液比对，指认4号、5号共有峰分别为补骨脂素和佛手柑内酯。（见图5）

图5 五指毛桃饮片的HPLC 叠加特征图谱（A）、对照特征图谱（B）和对照品溶液（C）的HPLC 图

2.6.6 相似度评价采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012年版）》对29批样品进行相似度评价。结果表明，29批样品的相似度在0.917~0.998之间，说明29批样品与对照特征图谱相似度较高。（见表6）

表6 五指毛桃饮片特征图谱相似度结果

3 讨论

3.1 指标性成分现代研究表明，五指毛桃含有多种化学成分[4,9]。其中以补骨脂素、佛手柑内酯为代表的苯丙素类成分备受学者关注，是评价五指毛桃质量的常见指标性成分[23-24]。此外，补骨脂素可测性好，能够以原型入血，且具有保肝作用[9]；佛手柑内酯的抗衰老、抗炎作用与五指毛桃的药理作用一致[25-27]。故本研究将补骨脂素和佛手苷内酯作为五指毛桃饮片含量测定的指标性成分。

3.2 薄层色谱本研究采用超声提取法分别考察了不同溶剂（甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚）对五指毛桃饮片展开效果的影响，结果发现甲醇、乙醇、乙醚作为提取溶剂对薄层斑点数量、斑点大小的影响差异不大。鉴于乙醚是管制溶剂，乙醇较甲醇经济、安全，故选用乙醇作为制备薄层色谱供试品的溶剂。本研究比较了正己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（体积比为20：0.4：0.5：0.7）[16]、正己烷-乙酸乙酯（体积比为4：1）[8]和环己烷-乙酸乙酯（5：2，V/V）[23]对供试品的展开效果，结果发现以正己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（体积比为20：0.4：0.5：0.7）为展开剂时，供试品展开后的斑点更加清晰，故选其作为展开剂。

3.3 浸出物中药饮片质量标准的制定应以临床应用为导向，建立并完善符合中医药特点的质量标准体系[28]。汤剂以水为溶媒，是我国传统医学中应用最早，也是目前中医临床中使用最广泛的剂型[29]，故本研究测定五指毛桃饮片的水溶性浸出物。

3.4 含量测定

3.4.1 HPLC条件本研究在确定HPLC流动相时，分别对有机相（甲醇、乙腈）和水相（水及不同比例的甲酸水、乙酸水、磷酸水）进行优选。结果发现，相较于甲醇，乙腈出峰多而杂，且分离难度大，故选择甲醇为有机相；磷酸水作为水相时，分离效果明显优于其他水相，且0.1%的磷酸水与0.2%的磷酸水对各峰分离效果无明显差异，故最终选定甲醇、0.1%的磷酸水为HPLC的流动相。

3.4.2 供试品的制备本研究首先考察了提取方法（超声提取、回流提取）、提取溶剂（甲醇、乙醇）对HPLC图的影响，结果发现甲醇的提取效果优于乙醇，且超声提取法和回流提取法对色谱峰的数量及峰面积的影响无明显差异。鉴于超声提取法操作简便，故本研究采用甲醇超声法制备供试品。本研究继而对甲醇浓度（50%、75%、100%）、提取时间（30、40、50、60 min）、料液比（20、50、100倍）、提取次数（1、2次）进行考察，结果发现高浓度甲醇比低浓度甲醇提取效果好，提取40 min后色谱峰数量及峰面积无明显变化，50倍与100倍料液比、提取1次和提取2次的提取效果均无明显差异。鉴于此，本研究最终选定供试品的制备方法为50倍量甲醇超声提取40 min。由于供试品直接进样，浓度偏低，故本研究采用浓缩、再复溶的方式对样品进行处理（具体见“2.5.2”项下内容）。

3.5 特征图谱中药是多成分、多靶点共同发挥药效的复杂整体，单一指标或几个指标的检测不能全面反映饮片的质量。特征/指纹图谱将中药整体成分以一张图谱的形式直观地展现出来，具有信息量大、特征性强、整体性和模糊性的特点，特别适合中药质量的整体性评价[30]。本研究建立了五指毛桃饮片的HPLC特征图谱，确定了11个共有峰，为五指毛桃饮片的整体质量控制提供了参考。

3.6 现有标准与本研究制定标准的比较五指毛桃曾被1977年版《中华人民共和国药典》（一部）收载[13]，但其饮片的质量标准却未曾记载。本研究制定的五指毛桃饮片质量标准与其现有标准相比（见表7），完善了质控指标，提高了质量标准。对于五指毛桃饮片的显微鉴别，增加了淀粉粒的鉴别要求；优化了薄层色谱供试品的制备方法，用乙醇替代了管制溶剂乙醚；相较于广东饮片炮制规范，提高了五指毛桃饮片水分、酸不容性灰分的质量标准；以中医临床应用为导向，制定了五指毛桃饮片水溶性浸出物的质量标准；新增了五指毛桃饮片的特征图谱鉴定方法及其含量测定要求，从整体化学成分定性与指标性成分定量相结合的角度进一步完善了五指毛桃饮片的质量标准。