心脑欣片HPLC指纹图谱建立及7种成分测定*

崔 兵，高 凡，田佳业，秦飘然，丁 哲，沈浩然，党静静，刘兴超,3,4

（1.景忠山国药（唐山）有限公司，河北 唐山 063000；2.河北中医学院，河北 石家庄 050200；3.河北省高校中药开发与产业化应用技术研发中心，河北 石家庄 050200；4.河北省中药组方制剂技术创新中心，河北 石家庄 050200）

心脑欣片由景忠山国药（唐山）有限公司研发，用于治疗气阴不足，瘀血阻滞所引起的头晕、头痛、心悸、气喘、乏力及缺氧引起的红细胞增多症[1]。心脑欣片由红景天、枸杞子和沙棘组成。传统藏药红景天为君药，具有益气活血、通脉平喘之功[2]，主要包括红景天苷、酪醇、没食子酸等化学成分[2]；枸杞子有滋肝补肾、益精明目之功效[3]。相关研究表明，枸杞子中咖啡酸、对香豆酸等有机酸类成分与其功效密切相关[4]。沙棘有健脾消食、止咳祛痰、活血化瘀之功效[3]。相关研究[5]表明，没食子酸、槲皮素等可作为沙棘功效相关的质量标志物。但现行质量标准及相关文献中仅检测了红景天苷和甜菜碱的含量，难以作为整体质量评价标准[6-7]。因此，应选择多种与功效相关的有效成分或主要成分作为检测指标来对心脑欣片进行全面质量控制。

鉴于中药复方具有多成分、多靶点的特点，通过高效液相色谱（HPLC）法建立中药指纹图谱可以更加全面地反映药材的整体化学成分类型[8-10]，而且结合化学识别模式和一测多评法可以更客观地反映中药的质量信息，达到综合评价中药整体质量的目的[11-12]。因此，本研究建立了心脑欣片HPLC指纹图谱，并采用一测多评法测定红景天苷、酪醇、没食子酸、没食子酸乙酯、对香豆酸、咖啡酸和绿原酸的含量，旨在为心脑欣片的质量控制和临床用药提供参考，也为其药效物质基础及作用机制的探索提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器 LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司）；WondaSil C18-WR色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；KQ-300DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ME204E102型电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）。

1.2 试剂与药物 红景天苷对照品（批号：AF21060954，纯度：98%）、酪醇对照品（批号：AF21051753，纯度：98%）、没食子酸对照品（批号：AF20050701，纯度：98%）、没食子酸乙酯对照品（批号：AF21022852，纯度：98%）、绿原酸对照品（批号：AF9082001，纯度：98%）、咖啡酸对照品（批号：AF21020856，纯度：98%）、对香豆酸对照品（批号：AF20041951，纯度：98%）均购自成都埃法生物科技有限公司；甲醇、磷酸为色谱纯；乙醇为分析纯；水为超纯水。心脑欣片共11批（编号：S1~S11，批号分别为201201、201202、201203、210101、210102，210103、211203、211204、211205、211206、211207）由景忠山国药（唐山）有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 WondaSil C18-WR色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脱（0~20 min，95%B~80%B；20~70 min，80%B~40%B）；流速为1.0 mL/min；柱温为35 ℃；检测波长为275 nm；进样量为20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 精准称取各对照品5 mg，分别加适量甲醇制备成红景天苷、酪醇、没食子酸、没食子酸乙酯、对香豆酸、咖啡酸、绿原酸质量浓度分别为4.500、1.025、1.425、0.085、0.115、0.090、0.100 mg/mL的对照品溶液。分别取上述7种对照品储备液适量，加入10 mL容量瓶中，50%甲醇定容至刻度，制得红景天苷、酪醇、没食子酸、没食子酸乙酯、对香豆酸、咖啡酸、绿原酸质量浓度分别为0.450 0、0.102 5、0.142 5、0.008 5、0.011 5、0.009 0、0.010 0 mg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取心脑欣片适量，研细，精确称取1 g，置于锥形瓶中，加入75%甲醇20 mL，超声处理30 min，放冷，75%甲醇补足减失的质量，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.3 阴性对照品溶液的制备 按处方比例制备缺红景天、缺枸杞子、缺沙棘的阴性对照品，按“2.2.2”项下供试品制备方法制备，即得。

2.3 HPLC指纹图谱建立

2.3.1 精密度试验 取心脑欣片供试品溶液（批号：211203）适量，按“2.1”色谱条件进样6次，以红景天苷为参照，测得各共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD值分别小于0.35%、0.67%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 取心脑欣片供试品溶液（批号：211203）适量，于0、4、8、12、16、24 h按“2.1”项下色谱条件进样测定，以红景天苷为参照，测得各共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD值分别小于0.46%、1.74%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.3 重复性试验 取同一批心脑欣片（批号：211203）6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件依次进样测定，以红景天苷为参照，测得各共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD值分别小于0.41%、1.89%，表明该方法重复性良好。

2.3.4 图谱生成及相似度评价 取11批心脑欣片样品S1~S11溶液，依次进样测定，将所得色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012.130723版本）》，设定样品S1为参照，时间窗宽度0.1 min，采用多点校正全谱峰匹配，共确定24个共有峰，平均值法生成指纹图谱共有模式（R）。（见图1）各批样品图谱与对照图谱的相似度分别为0.967、0.992、0.987、0.990、0.992、0.990、0.988、0.974、0.973、0.991、0.980、1.000，均大于0.960，以5号峰（红景天苷）为参照，测得共有峰相对保留时间、相对峰面积的RSD值分别为0.03%~0.25%、1.92%~16.07%，表明不同批次样品所含成分差别不大，但各成分含量有一定差异。

图1 11 批样品HPLC 指纹图谱（A）及混合对照品HPLC 色谱图（B）

2.3.5 聚类分析 采用SPSS 26.0软件，以共有峰相对峰面积为变量，组间连接和平欧式距离法绘图。结果显示，11批样品聚为3类，第1类为S1，第2类为S2、S3、S4、S5、S6，第3类为S7、S8、S9、S10、S11。（见图2）表明不同批次间心脑欣片存在差异，但差异并不明显。

图2 11 批样品树状图

2.3.6 主成分分析 采用SPSS 26.0软件进行主成分分析，提取得到特征值大于1的4个主成分，其累积方差贡献率达95.045%，说明所提取成分可以代表11批样品HPLC指纹图谱中各成分的大部分信息。（见表1）载荷矩阵可直观反映各个变量对主成分的综合贡献[13]，结合表1特征值和方差贡献率、因子载荷矩阵进行考察，可知色谱峰16（对香豆酸）、18、20、21、22、23号对主成分1贡献率较大，色谱峰3（没食子酸）、8（酪醇）、9号对主成分2贡献率较大，色谱峰5、6、13（没食子酸乙酯）号对主成分3贡献率较大，色谱峰7（红景天苷）、11（咖啡酸）号对主成分4贡献率较大。（见表2）再采用SIMCA 14.1软件绘制得到主成分分析得分图，可知11批样品主要分成3类，与聚类分析结果一致。（见图3）

表1 主成分特征值及方差贡献率

表2 主成分因子载荷矩阵

图3 主成分分析得分图

2.4 一测多评法测定各成分含量

2.4.1 系统适应性考察 精密吸取混合对照品、供试品、阴性对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进行测定。结果表明，各成分色谱峰分离度均符合要求，理论塔板数均大于5 000，阴性样品无干扰。（见图4）

图4 各成分HPLC 色谱图

2.4.2 线性关系考察 将“2.2.1”项下混合对照品储备液分别用50%甲醇稀释0、2、4、8、16、32、64倍，按“2.1”项下色谱条件进样测定。以对照品质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归。结果见表3。

表3 各成分线性关系

2.4.3 精密度试验 精确吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液，在“2.1”项下色谱条件进样测定6次，结果没食子酸、红景天苷、酪醇、绿原酸、咖啡酸、没食子酸乙酯、对香豆酸峰面积RSD值分别为0.23%、0.21%、0.34%、0.54%、0.67%、0.25%、0.28%，表明仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 取心脑欣片供试品溶液（批号：211203）适量，于0、4、8、12、16、24 h依次进样，结果没食子酸、红景天苷、酪醇、绿原酸、咖啡酸、没食子酸乙酯、对香豆酸峰面积RSD值分别为1.69%、0.91%、1.37%、1.58%、1.68%、1.41%、0.84%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.5 重复性试验 取同一批次心脑欣片（批号：211203）6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，测得没食子酸、红景天苷、酪醇、绿原酸、咖啡酸、没食子酸乙酯、对香豆酸峰面积RSD值分别为1.89%、0.13%、0.28%、1.06%、1.83%、0.21%、0.20%，表明该方法重复性良好。

2.4.6 加样回收率试验 精确称取同一批心脑欣片样品0.5 g，共7份，置于10 mL容量瓶中，精密加入“2.2.1”项下混合对照品溶液（含红景天苷0.450 0 mg/mL、酪醇0.102 5 mg/mL、没食子酸0.142 5 mg/mL、没食子酸乙酯0.008 5 mg/mL、对香豆酸0.0115 mg/mL、咖啡酸0.009 0 mg/mL、绿原酸0.010 0 mg/mL）5 mL，甲醇定容进样，计算回收率。结果测得没食子酸、红景天苷、酪醇、绿原酸、咖啡酸、没食子酸乙酯、对香豆酸平均加样回收率分别为104.02%、97.09%、96.76%、100.08%、97.12%、102.98%、98.82%，RSD值分别为0.06%、0.35%、0.89%、0.06%、0.05%、1.48%、1.26%。

2.4.7 相对校正因子（fk/s）计算 精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液适量，用甲醇依次进行等倍比稀释，共7个浓度点，依次在“2.1”项下色谱条件进样测定，以没食子酸为内标，计算其他6种成分fk/s，公式为fk/s=fk/fs=（CkAs）/（CsAk）。结果见表4。

表4 各成分相对校正因子

2.4.8 耐用性试验 通过考察Thermo Acclaim 120、Agilent Eclipse Plus C、WondaSil CWR3个色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）及Waters e2695、Agilent 1260、Shimadzu LC-20A 3种色谱仪对各成分fk/s的影响。结果显示对检测结果均无明显影响（RSD值＜5%）。（见表5）

2.4.9 样品含量测定 取11批样品，分别采用外标法、一测多评法计算含量。结果显示2种方法所得结果无明显差异，表明一测多评法合理可行。（见表6）

表6 各成分含量测定结果 （mg/g）

3 讨论

3.1 指标成分、内标选择 多成分的综合测定成为中药质量控制研究的重点。建立质量标志物群的“一测多评法”方法，成为解决指标成分单一问题的关键[18]。本研究根据心脑欣片3味组方药材的主要成分及其药理作用，结合一测多评指标选择原则和中药质量标志物确认原则[14]以及分析2020年版《中华人民共和国药典》心脑欣胶囊中指标性成分，检测了红景天的红景天苷和枸杞中的甜菜碱。甜菜碱的检测方法为薄层色谱法，但本研究采用的是高效液相色谱法，且甜菜碱化学结构（见图5）与氨基酸类似，紫外吸收很弱。因此本研究选择组方中红景天苷、酪醇、没食子酸、没食子酸乙酯、对香豆酸、咖啡酸和绿原酸作为指标成分[3-5]，并选定峰面积最大、峰型较好的没食子酸作为内标。

图5 甜菜碱的结构式

3.2 提取条件选择 本研究考察了供试品溶液的提取方式（回流、超声）、提取溶剂（25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇）、提取时间（20、30、40min）和提取料液比（0.5g：20 mL、1 g：20 mL、2 g：20 mL）对各成分提取效率的影响。综合考虑效益成本及单位质量各色谱峰峰面积，本研究最终确定供试品溶液制备方法为以75%甲醇按料液比1 g：20 mL超声提取30 min。

3.3 波长的选择 红景天苷、酪醇、没食子酸等在275 nm处有最大吸收[15-16]，而绿原酸在324 nm处有最大吸收[17]。在心脑欣片的指纹图谱研究中，通过与混合对照品的保留时间及紫外吸收波长比对，比较不同波长条件下各峰的响应值、分离度、对称性及拖尾因子等参数，本研究最终选择275 nm作为检测波长。在该波长下，各峰分离度、峰形对称性良好。

综上所述，心脑欣片HPLC指纹图谱中有24个共有峰，相似度均在0.960以上，表明该制剂生产工艺稳定，各组分之间差异不大，但不同批次样品中各成分含量有一定差异。聚类分析结果显示，心脑欣片分为3类，且主成分分析提取到的4个主成分能代表95.045%的共有峰信息，表明不同批次产品存在一定的差异性。外标法、一测多评法所得结果基本一致，表明该试验建立的一测多评法可用于心脑欣片中各成分含量测定，为全面评价心脑欣片质量提供了科学依据，同时有利于药品生产企业和监管部门提升心脑欣片的质量控制标准，确保临床用药疗效的一致性。