茴香提取液对小鼠肝纤维化的干预作用*

黄景珠，莫 庸，黄森平，黄石凤，周雅婷，陈冬梅，邹兰兰，李杰鸿，程晴晴，周晓媛，方晓燕，黄丽娟

（右江民族医学院，广西 百色 533000）

肝纤维化是继发于各种原因引起的肝脏炎症或损伤后肝组织修复过程的代偿性反应，是各种慢性肝病进展为肝硬化的共同病理过程，是肝硬化、肝癌发生和发展的中间环节[1]。而中药在治疗肝纤维化方面则有其独特的优势，主要体现在中药具有多种成分，可作用于多个靶点，通过多种途径、多个环节来发挥其治疗作用。伞形科植物茴香（Foeniculum vulgareMill.）是我国许多少数民族常用药，其常作为一种治疗肝病的药物使用。相关的实验研究发现小茴香（茴香果实）具有护肝[2-3]、抗氧化[4-5]及抗肝纤维化[6-8]作用。本课题组前期利用壮药茴香茎叶进行研究，结果发现，茴香提取液对糖尿病肝损伤及急性酒精性肝损伤均有保护作用[2，9]。本研究拟通过四氯化碳（CCl4）复合酒精构建小鼠肝纤维化模型，进一步探讨茴香提取液干预治疗肝纤维化的效应，为开发广西壮药茴香抗肝纤维化提供理论和实验依据。

1 材料

1.1 实验动物 SPF级昆明种雄性小鼠40只，体质量为（23±2）g，由右江民族医学院实验动物中心提供，动物生产许可证号：（SCXK桂2017-0003），该实验经右江民族医学院医学伦理委员会批准，动物伦理审查号：2018091503。实验地点为右江民族医学院实验动物中心SPF级实验室，温度为26 ℃，相对湿度为40%~70%。

1.2 药品与试剂 茴香（Foeniculum vulgare），百色市市售原植物，经右江民族医学院民族医学覃道光教授鉴定为茴香的茎叶；北京二锅头56°白酒（批号：20180916）购买于北京二锅头酒业股份有限公司；橄榄油（批号：GB723347）购买于广州粮油工业有限公司；CCl4（批号：20180718）购买于天津市富宇精细化工有限公司；蛋白定量、SOD、MDA检测试剂盒（批号分别为：20181218、20181226、20181226）均购买于南京建成生物工程研究所；透明质酸（HA）、层黏连蛋白（LN）ELISA试剂盒（批号分别为：201901、201901）均购买于上海恒远生物科技有限公司；Masson染液（批号：20181221）购买于南京建成科技有限公司。

1.3 仪器 日立全自动7600生化分析仪（株式会社日立高新技术公司）；722型可见分光光度计（上海精科实业有限公司）；多功能酶标仪（德国Berthold公司）。

2 方法

2.1 茴香提取液的制备 将原植物茴香茎叶晒干，粉碎，取茴香500 g，用2 000 mL的水浸泡茴香40 min，将液体盛于玻璃容器内，进行微波处理,然后用5 000 mL的水分两次浸提，每次30 min，最后将两次药液混合并浓缩至每1 mL含生药分别为0.5、1.0 g、1.5 g，分装于-20 ℃保存备用。

2.2 分组与造模 将健康雄性小鼠随机分为2组：正常对照组8只、肝纤维化模型组32只。正常对照组腹腔注射橄榄油，肝纤维化模型组腹腔注射12%CCl4橄榄油溶液造模，用量0.1 mL/10 g，3 d/次，连续8周，同时肝纤维化模型组给予5%北京二锅头56°白酒饮用水，8周后，随机抽取小鼠观察肝组织病理形态学改变证实肝纤维化模型已经建立成功；将造模成功的小鼠随机分为模型组及茴香高、中、低剂量组（15、10、5 g/kg）。茴香高、中、低剂量组给予相应的药液灌胃给药（1次/d），空白组和模型组给予等量的蒸馏水，连续灌胃给药5周。给药治疗期间，除正常对照组给予腹腔注射橄榄油+蒸馏水饮用水外，其他组继续腹腔注射12%CCl4橄榄油溶液+5%北京二锅头56°白酒饮用水造模，用量0.1 mL/10 g，1次/周，维持3周。

2.3 指标检测 末次给药后禁食12 h，摘除眼球取血，收集血液标本，离心取血清。采用日立全自动7600生化分析仪测血清天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）；ELISA测定肝纤维化指标：透明质酸（HA）、层黏连蛋白（LN）。取肝左叶0.5 g，以1：9（m/V）的冰生理盐水制成10%肝组织匀浆。用722型可见分光光度计按试剂盒说明书操作，用考马斯亮兰法（波长595 nm）测定肝组织蛋白，用羟胺法（波长550 nm）测定肝组织超氧化物歧化酶（SOD），用硫代巴比妥酸法（TBA法，波长532 nm）测定肝组织丙二醛（MDA）。另取肝组织甲醛固定、常规石蜡包埋，HE染色，观察各组肝组织病理形态学改变；胶原纤维染色（Masson染色）观察胶原纤维染色情况。

2.4 统计学方法 数据处理采用SPSS 22.0软件统计分析，采用单因素方差分析进行各组之间的比较，各组数据以“均数±标准差”（±s）表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 茴香提取液对肝纤维化小鼠血清ALT和AST的影响 与正常对照组相比，模型组血清ALT和AST酶活性显著增高（P＜0.01）。与模型组相比，茴香低、中、高剂量组ALT、AST酶活性显著降低（P＜0.05或P＜0.01）；茴香高剂量组ALT酶活性明显低于茴香低剂量组（P＜0.01）。（见表1）

表1 茴香提取液对小鼠血清ALT 和AST 的影响（±s，U/L）

表1 茴香提取液对小鼠血清ALT 和AST 的影响（±s，U/L）

注:与正常对照组比较，aP＜0.05，bP＜0.01；与模型组比较，cP＜0.05，dP＜0.01，与茴香低剂量组比较，eP＜0.01。

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3.2 茴香提取液对肝纤维化小鼠血清HA和LN的影响 与正常对照组比较，模型组HA、LN明显升高（P＜0.01）。与模型组相比，茴香低、中、高剂量组HA和LN明显降低（P＜0.05或P＜0.01）。茴香高剂量组HA和LN明显低于茴香低剂量组（P＜0.01）。（见表2）

表2 茴香提取液对小鼠血清HA 和LN 的影响（±s，U/L）

表2 茴香提取液对小鼠血清HA 和LN 的影响（±s，U/L）

注：与正常对照组比较，aP＜0.05，bP＜0.01；与模型组比较，cP＜0.05，dP＜0.01，与茴香低剂量组比较，eP＜0.01。

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3.3 茴香提取液对肝纤维化小鼠肝组织SOD和MDA的影响与正常对照组相比，模型组SOD活性水平降低，MDA水平升高（P＜0.01）。与模型组比较，茴香高剂量组SOD活性明显升高，MDA水平明显降低，茴香中剂量组MDA水平明显降低（P＜0.05）。（见表3）

表3 茴香提取液对小鼠肝组织SOD 和MDA 的影响（±s）

表3 茴香提取液对小鼠肝组织SOD 和MDA 的影响（±s）

注：与正常对照组比较，aP＜0.05，bP＜0.01；与模型组比较，cP＜0.05。

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3.4 茴香提取液对肝纤维化小鼠肝组织病理形态学的影响HE染色显示，正常对照组小鼠肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，排列整齐，肝小叶结构完整，Masson染色仅见少许胶原纤维染色，无胶原纤维增生。模型组小鼠肝细胞排列紊乱，纤维结缔组织增生，大量炎症细胞浸润，可见假小叶形成；Masson染色显示汇管区和中央静脉周围有大量蓝色胶原纤维增生，增多的胶原纤维形成条状纤维间隔。茴香低、中、高剂量组对纤维化程度均有不同改善，以茴香高剂量组改善作用显著。（见图1）

图1 各组小鼠肝组织病理学形态变化

4 讨论

肝纤维化是指多种原因导致肝脏损害，肝细胞发生炎症刺激及坏死,肝脏中细胞外基质（ECM）异常增生而过多沉积于肝内，进而导致肝脏内纤维结缔组织异常沉积的病理过程。ECM包括胶原蛋白、HA、LN等多种成分，其中HA、LN是肝脏基质代谢产物。血清HA、LN水平可侧面反映出肝脏ECM的代谢情况，同时也能反映出肝纤维化的进展情况[10]。肝纤维化时，HA的合成与降解失衡，肝星状细胞合成HA增加，而肝内皮细胞对HA降解能力降低，从而导致血清中HA水平明显增高[11]。LN是基底膜的主要成分。肝纤维化时，随肝窦内皮细胞的胶原沉着形成基膜而毛细血管化，血清中LN增高[12]。一项临床研究[13]表明，HA和LN可反映肝组织肝纤维化程度，增高程度与纤维化程度呈正相关。这些指标可用于判断肝纤维化的严重程度。肝纤维化进程中也常伴有不同程度的肝脏损伤。相关研究[14]显示，ALT与AST常被用于评估肝脏损伤的程度。本实验通过腹腔注射CCl4复合5%北京二锅头56°白酒饮用水构建小鼠肝纤维化模型。结果显示，与正常对照组比较，模型组ALT、AST、HA、LN显著升高（P＜0.01），肝组织中有大量胶原纤维的增生，说明肝纤维化造模成功并出现明显的肝功能损害，肝脏有大量的胶原蛋白沉积。经茴香提取液干预治疗的各实验组ALT、AST、HA和LN显著降低（P＜0.05），其中茴香高剂量组ALT酶活性、HA和LN明显低于茴香低剂量组（P＜0.01）。进一步病理形态学实验表明，茴香各给药组肝小叶结构破坏程度减轻，胶原纤维程度明显减轻且增生的胶原纤维较模型组纤细菲薄。茴香低、中、高剂量组对纤维化程度均有不同改善，以茴香高剂量组改善作用显著。说明茴香提取液可以减轻肝细胞损伤和胶原纤维的增生，改善肝纤维化程度，提示茴香提取液具有缓解和逆转肝纤维化的功效。

此外，抗氧化应激在逆转肝纤维化发生、发展中也发挥着关键作用[15-16]。在肝纤维化的形成过程中，肝脏的脂质过氧化损伤使ROS激活，ROS激活后HSC大量增殖。高水平的氧化应激可刺激ECM过度分泌，致使胶原沉积[17]，同时持续的慢性炎症和氧化应激失衡可能促进肝纤维化功能障碍，最终导致肝硬化[18]。已有研究[19-20]显示，SOD活性、MDA含量可反映机体氧化应激损伤发生情况。SOD主要清除体内过多的氧化应激产物，可反映自由基的清除速度；MDA可反映机体脂质过氧化物的代谢水平。本实验研究结果显示，在肝组织中，模型组SOD活性水平降低，MDA水平升高，而与模型组比较，茴香高剂量组SOD活性明显升高，MDA水平明显降低，说明茴香提取液可通过减轻脂质过氧化反应、清除自由基而缓解和改善肝纤维化的作用。

综上所述，茴香对CCl4复合酒精诱导肝纤维化小鼠具有治疗作用，可以改善肝脏功能，保护肝细胞和缓解肝纤维化，减轻CCl4复合酒精诱导小鼠肝纤维化程度。