1例FGA基因c.2185G>A变异所致遗传性异常纤维蛋白原血症并发深静脉血栓的分析*

潘晓浩,何卫,黄建芳,郑晓勇

(1.温州市中西医结合医院检验科,浙江温州 325001;2.温州医科大学附属第一医院医学检验中心,浙江温州 325015)

纤维蛋白原(fibrinogen,Fg)也称凝血因子Ⅰ,主要由肝脏合成的一种糖蛋白,血浆浓度约为1.5～4.0 g/L[1]。Fg作为凝血酶的关键底物直接参与凝血过程的共同途径,并且通过连接活化的血小板建立巩固的纤维蛋白网络,从而发挥重要的止血作用[2]。遗传性纤维蛋白原缺陷症(congenital fibrinogen deficiency,CFD)是指由于纤维蛋白原基因FGA、FGB、FGG缺陷导致纤维蛋白原含量和/或结构异常的一种遗传性疾病,呈常染色体隐性、显性或共显性遗传[3],包括两种类型:Ⅰ型是一种定量缺陷,其特征为循环血液中纤维蛋白原检测不到(无纤维蛋白原血症)或降低(低纤维蛋白原血症);Ⅱ型是一种定性缺陷,其特征为纤维蛋白原活性下降而抗原水平正常(异常纤维蛋白原血症)或纤维蛋白原活性及抗原均下降但不成比例(低且异常纤维蛋白原血症)[4]。深静脉血栓形成(deep venous thrombosis,DVT)是指血液在深静脉内非正常凝结引起的静脉回流障碍性疾病,常发生于下肢深静脉或髂股段近端静脉。DVT的主要不良后果是肺动脉栓塞和血栓形成后综合征,可以显著降低患者的生活质量,甚至导致死亡[5]。本研究对1例由FGA基因错义变异导致的遗传性异常纤维蛋白原血症(congenital dysfibrinogenemia,CD)患者出现DVT进行临床资料和基因变异分析,探讨FGA基因变异与DVT的关系。

1 对象与方法

1.1研究对象 选择2021年12月于温州医科大学附属第一医院妇科收治的1例子宫肌瘤患者作为研究对象。调查患者及家系其他成员共2代3人,均无自发性出血倾向及血栓形成史,否认父母近亲婚配。家系遗传图谱见图1。

c.2185G>A杂合变异女性先证者正常男性已故男性正常女性已故女性

1.2主要仪器与试剂 STA-R Max自动血液凝固分析仪及配套试剂(法国Stago公司),TC-96/G/H(b)A LifePro热循环仪(赛默飞世尔科技公司),3730XL基因测序仪(美国ABI公司),AU5800自动生化分析仪(美国Beckman Coulter公司);DNA提取试剂盒(批号:S7425)由北京天根生化科技公司购入,纤维蛋白原检测试剂盒(批号:220302)由浙江伊利康生物技术有限公司提供。引物:根据参考文献[6],由上海桑尼生物科技公司合成覆盖FGA、FGB和FGG基因所有外显子区域及侧翼序列的26对引物。

1.3标本采集与处理 采集研究对象外周静脉血2.7 mL,以0.109 mol/L枸橼酸钠1∶9抗凝,3 000 r/min离心15 min,上层乏血小板血浆用于凝血指标的检测,下层血细胞用于提取基因组DNA。

1.4实验室表型指标检测 在STA-R Max自动血液凝固分析仪上采用凝固法检测凝血酶原时间(prothrombin time,PT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)、凝血酶时间(thrombin time,TT)和纤维蛋白原活性(Fg activity,Fg:C);免疫比浊法检测D-二聚体(D-Dimer,DD)和纤维蛋白(原)降解产物(fibrin degradation products,FDPs)含量。在AU5800自动生化分析仪上检测纤维蛋白原抗原(Fg antigen,Fg:Ag)含量。所有操作均严格按照试剂和仪器说明书进行。

1.5DNA提取及PCR扩增 采用DNA提取试剂盒提取先证者及其家系成员的外周血基因组DNA。PCR反应体系包括2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL,双蒸水8.0 μL,DNA模块2.0 μL,10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL。用LifePro热循环仪扩增,反应条件:95 ℃预变性5 min,95 ℃变性30 s,55 ℃/56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共30个循环,再72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。PCR产物送上海桑尼生物科技公司进行电泳和纯化,然后使用3730XL基因测序仪进行直接测序。

1.6测序分析 通过Chromas软件与美国NCBI基因库所公布的FGA、FGB和FGG基因序列(GenBank M64982、M64983和M10014)进行比对,分析测序峰图,发现变异位点后检测家系成员相应的变异位点区域。

1.7蛋白模型分析 用PyMol软件分析FGA基因变异前后Fg蛋白结构的改变。

2 结果

2.1临床资料 先证者,女性,47岁,汉族,为行子宫肌瘤切除术入院。既往无肝肾疾病史,也无明显自发性出血倾向,自述月经不规律,周期为30～60天,经量近2年来较前增多。入院当日实验室检查:白细胞计数9.64×109/L,血红蛋白108 g/L,血小板计数130×109/L,PT 14.9 s,TT 33.3 s,Fg:C 0.94 g/L;肝、肾功能及肿瘤标志物均正常。由于患者凝血功能存在异常,临床予术前分次输注血浆(总计1 000 mL)。后按计划进行手术,术中出血约200 mL。术后静脉滴注人纤维蛋白原1 g,并复查双下肢静脉B超示:两侧下肢深静脉无明显异常发现。术后3天患者诉下肢肿胀感,予再查双下肢静脉B超示:右侧胫后及腓静脉血栓形成、两侧小腿肌间静脉丛血栓形成。考虑患者目前抗凝风险较大,暂不使用抗凝药物,继续监测血栓变化,注意防范发生肺栓塞,后患者血栓自行消融出院。

2.2先证者及其家系成员实验室表型检测结果 先证者和其母亲TT延长,PT稍延长,Fg:C降至正常对照的一半左右;其父亲TT、PT和Fg:C均正常,家系成员其他凝血指标均无明显异常(见表1)。

表1 先证者及其家系成员主要实验表型及基因检测结果

2.3先证者及其家系成员基因分析结果 先证者及其母亲的FGA基因第6号外显子均存在c.2185G>A杂合错义变异(p.Glu729Lys),其父亲该位点为野生型(表1、图2)。

注:A,先证者c.2185G>A杂合错义变异;B,c.2185G野生型;箭头所示为变异的位置。

2.4蛋白质模型分析结果 在野生型FGA蛋白中,带负电荷的酸性氨基酸Glu729,分别与Arg854形成4个氢键,与Ala855形成2个氢键;当它变异为带正电荷的碱性氨基酸Lys729后,与Ala855形成的氢键不变,与Arg854仅形成1个氢键,且侧链结构发生改变,从而导致Fg蛋白结构改变(图3)。

注:A,野生型;B,变异型;绿色虚线表示氢键。

3 讨论

CD是由Fg基因(FGA、FGB、FGG)变异导致血浆中Fg:C下降而Fg:Ag基本正常的一种常染色体遗传性疾病[7],其中FGA和FGG基因杂合错义变异导致的CD占大多数。CD患者临床表现呈现多样性,无症状者约占55%,有出血症状者占25%,有血栓形成者占20%,部分患者既有出血表现也有血栓形成[8]。目前通过对基因组数据库中约140 000个个体的外显子/基因组数据进行系统分析,估计其患病率高达0.3%至1%[9]。对于CD的诊断,目前国内外尚无统一的标准,医生对该病的认识不足,容易造成患者被漏诊或误诊[10]。关于CD的治疗英国血友病中心医师组织建议:对于轻度出血或要进行小手术的患者,可考虑单独使用氨甲环酸;对于严重出血或要进行大手术的患者,可考虑使用浓缩纤维蛋白原,以维持Fg:C>1.0 g/L;对于个人或家族史中有严重出血或Fg:C<0.1 g/L的患者,可考虑使用浓缩纤维蛋白原进行长期预防,以维持Fg:C>0.5 g/L;对于无症状且无出血/血栓形成家族史的患者,可考虑在术后进行常规血栓预防,但只在异常出血时才进行纤维蛋白原替代治疗[11]。

本研究中的先证者为一名47岁女性,此次为行子宫肌瘤切除术入院,平素无自发性出血倾向也无血栓形成史,术前发现Fg:C为0.94 g/L。为纠正凝血功能,术前分次输注了血浆,术后静脉滴注人纤维蛋白原,术后3天发现患者出现双下肢静脉血栓形成。进一步检查发现该患者Fg:Ag为2.10 g/L,Fg:C/Fg:Ag为0.45,排除继发性因素及家系调查后,考虑可能为CD患者。基因分析发现先证者及其母亲的FGA基因第6号外显子均存在c.2185G>A杂合错义变异(p.Glu729Lys),测序结果与实验室表型相符。该患者出现双下肢静脉血栓形成可能与手术、输注血浆及CD共同作用有关。

Fg是由位于4号染色体(4q28-30)长臂端的3个独立基因FGA、FGB、FGG按顺序编码产生的3条同源多肽链Aα、Bβ、γ,通过29个二硫键连接最终形成的一种相对分子质量为340 kDa对称性六聚物[(AαBβγ)2],主要包括1个中央E区和2个外周D区[12]。近年来研究发现[13],血浆中还存在另外一种具有αE结构域,相对分子质量为420 kDa的Fg。αE结构域是由FGA基因第6外显子编码产生,αE的球形羧基末端(αEC)由236个氨基酸残基组成,与β链和γ链的C末端非常相似。Aα链的羧基末端(αC)可与活化凝血因子、纤溶酶原和组织型纤溶酶原激活物相互作用,该结构域还通过与其他αC结构域形成分子间关联来实现Fg的侧向关联,从而直接促成血栓的形成[14]。由于αE结构域位于αC上,因此高度表明该结构域在Fg的细胞内组装中发挥着重要的作用。本文中的c.2185G>A杂合错义变异位于Aα链C端的αE区域,Li等[15]对该变异位点分析表明p.Glu729在同源氨基酸序列间呈高度保守,4个在线生物信息学软件预测均显示为有害变异。蛋白质模型分析显示p.Glu729Lys变异使得氨基酸侧链发生了改变,与Arg854形成的氢键数量减少了,导致αE区域空间结构紊乱产生空间位阻,阻止同一Fg分子中2个延长链的连接,从而影响纤维蛋白原的组装,使得Fg:C水平下降。也有研究表明[16],αC区域的变异容易出现血栓形成或异常出血。

另外,根据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)遗传变异分类标准和指南,c.2185G>A变异属于可能致病变异。

综上,本研究通过对1例Fg:C降低并出现DVT患者进行分析,发现了1个FGA基因c.2185G>A杂合错义变异,该变异不仅与患者及其家系成员Fg:C水平降低有关,而且可能也是该患者出现DVT的原因之一,但具体致病机制还有待进一步研究。