基于网络药理学分析青蒿鳖甲汤治疗癌性发热的作用机制

谭琴,黄礼明,肖雪,郑周波

发热是癌症患者最常见的临床并发症之一,在排除了其他可识别的发热病因后,由癌症本身所引起的发热,通常称为癌性发热,临床表现常以发热和汗出为特征,但患者恶寒或寒战并不明显且少有心动过速和精神变化的表现,其发病机制目前仍不确定。目前部分非甾体抗炎药已被证明可用于治疗癌性发热,但药物有明显不良反应[1]。因此,癌性发热的治疗在临床上是一个亟待解决的难题。

传统医学通常将癌性发热归属于“内伤发热”,中医认为大多癌症患者由于病情迁延日久、邪毒侵袭,又或是现代医学中放化疗等方式可使机体阴阳气血虚衰、脏腑功能失调,复加多种致病因素的干扰,易致机体发热,其中大部分患者又属于阴液耗损所致的阴虚发热。癌症患者正虚本易感邪气,加之邪气入里深达营分,损伤营阴,则会出现阴液亏虚、邪气为患的表现,如发热,尤其午后或夜间多发,以低热为主[2]。青蒿鳖甲汤具有养阴透热之功效,目前临床上也多用于治疗各类原因导致的发热。在多次临床观察及实验分析等方面都发现青蒿鳖甲汤及其加减方在治疗癌性发热方面疗效显著,但目前关于其在治疗癌性发热方面潜在成分—靶点方面的研究尚不足且鲜有报道。本研究旨在通过网络药理学初步分析青蒿鳖甲汤在治疗癌性发热方面的潜在作用机制,为青蒿鳖甲汤在治疗癌性发热的临床应用方面提供更完善的理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究所用数据库、网页及软件 TCMSP,HERB,PubChem,Swiss Target Prediction,GeneCards,Uniprot,STRING,DAVID,Draw Venn Diagram与微生信及Cytoscape 3.9.1软件。

1.2 研究方法

1.2.1 青蒿鳖甲汤活性成分的收集与筛选:设定OB≥30%、DL≥0.18在TCMSP数据库中筛选出青蒿鳖甲汤的潜在优效活性成分。在TCMSP中不能搜索到的鳖甲及生地相关信息另外借助HERB数据库进行检索并通过Lipinsk五原则中的设定Mw≤500筛选潜在活性成分。在PubChem数据库中检索出相应的SMILES和化学结构式。

1.2.2 青蒿鳖甲汤潜在靶点的预测筛选:在Swiss Target Prediction数据库中导入已获得的成分结构式以预测其相关作用靶点,根据相关性选取潜在作用靶点后使用Uniprot数据库对靶点蛋白的潜在靶点进行名称标准化、去除重复靶基因并通过Cytoscape 3.9.1软件构建“药物—成分—靶点图”。

1.2.3 癌性发热相关靶点预测:以“Cancerous fever”为关键词,利用GeneCards数据库获得癌性发热的疾病靶点。

1.2.4 青蒿鳖甲汤与癌性发热共同靶点预测:将青蒿鳖甲汤中活性成分的靶点与癌性发热的关键靶点进行取交集取得共同靶点后通过Draw Venn Diagram在线分析绘制韦恩图。

1.2.5 药物—疾病PPI网络的构建:将共同靶点导入STRING数据库中,得到青蒿鳖甲汤与癌性发热的PPI网络图。再使用Cytoscape 3.9.1软件对获取的靶蛋白相互作用数据进行可视化,并利用其中的CytoHubba插件筛选出总网络中相关性最强的前top10靶点。

1.2.6 GO与KEGG富集分析:使用DAVID数据库的“Functional Annotation Tool”板块在线分析获得的药物—疾病共同靶点蛋白,得出共同靶点的GO和KEGG通路富集分析。获得生物过程(BP)、细胞成分(CC)和分子功能(MF)3个部分的GO分析,以P<0.05和FDR<0.05为标准筛排序筛选,各选取前20位;KEGG通路分析方面,根据P值(P<0.01)的大小排序选取前20条通路。借助“微生信”平台富集气泡图板块绘制气泡图可视化。

1.2.7 KEGG“通路—靶点”关系网络构建:将已选取的KEGG分析中的前20条通路利用Cytoscape 3.9.1软件构建青蒿鳖甲汤治疗癌性发热的“通路—靶点”关系网络图。

2 结 果

2.1 青蒿鳖甲汤优效活性成分、靶点筛选以及网络构建 在TCMSP分析平台中筛选出青蒿、知母、丹皮的潜在优效活性成分共32个,在HERB数据库中筛选出鳖甲、生地潜在优效活性成分共8个,见表1。

表1 青蒿鳖甲汤优效活性成分、靶点筛选的网络构建结果

通过PubChem检索活性成分的规范SMILES和化学结构式后经Uniprot及Swiss Target Prediction数据库筛选预测相关作用靶点,以“probability>0.5”为条件,剔除重复项获得青蒿鳖甲汤潜在作用靶点共229个,通过Cytoscape 3.9.1软件构建“药物—成分—靶点图”(图1,见封三)。

注:红色图形代表药物(A青蒿,B知母,C丹皮,D鳖甲,E生地);淡紫色菱形代表优效活性成分;淡绿色矩形代表靶点

2.2 癌性发热相关靶点检索 在GeneCards数据库中检索得到癌性发热疾病相关靶点7 462个,取relevance score>10者共1 262个。

2.3 青蒿鳖甲汤、癌性发热共同靶点预测 通过Draw Venn Diagram在线分析,得到药物与疾病共同靶点132个并绘制韦恩图(图2)。

图2 青蒿鳖甲汤与癌性发热共同靶点韦恩图

2.4 青蒿鳖甲汤治疗癌性发热的PPI网络构建 在STRING数据库中构建青蒿鳖甲汤—癌性发热共同靶点的PPI网络图,将“tsv”文件导入Cytoscape 3.9.1软件中,对所获取的靶蛋白互作数据进行可视化(图3)。

图3 青蒿鳖甲汤—癌性发热共同靶点相互作用图

2.5 青蒿鳖甲汤治疗癌性发热的核心靶点筛选 利用Cytoscape 3.9.1软件筛选出总网络中相关性最强的前top10靶点并可视化(图4),分别为VEGFA、CASP3、AKT1、MMP9、TNF、HIF1A、EGF、TP53、PTGS2及IL6,说明以上10个靶点在青蒿鳖甲汤治疗癌性发热的作用机制中发挥着重要作用。

图4 关键靶点相互作用网络图

2.6 青蒿鳖甲汤治疗癌性发热通路的富集分析 将132个共同靶点提交至DAVID数据库进行富集分析,得到了BP条目778条,CC条目71条,MF条目140条。KEGG条目125条,主要涉及癌症的通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、前列腺癌等。分别以P<0.05为标准筛选选取排名在前20位的BP、CC、MF及KEGG通路分析结果,随后将结果在“微生信”平台上进一步绘制气泡图进行可视化(图5)。

注:(a)GO-BP分析,(b)GO-CC分析,(c)GO-MF分析,(d)KEGG分析;显著性越强,P值越小,气泡越绿;count值越大,气泡越大;横坐标为FDR值,纵坐标为BP、CC、MF和KEGG通路名称

2.7 KEGG“通路—靶点”关系网络的构建 按P值所示显著性选取KEGG通路分析中的前20条通路,利用Cytoscape 3.9.1软件构建KEGG“通路—靶点”关系网络图(图6,见封三)。

注:图中淡紫色矩形为靶点基因,淡绿色菱形为通路

3 讨 论

尽管癌性发热的发病机制目前尚未明确,但有研究表明可能的原因主要有患者本身癌细胞可释放致热细胞因子引起发热;其次,这些细胞因子还可能激活下丘脑的前视前核,并通过诱导前列腺素E2参与机体发热、炎性反应等过程从而提高机体体温的设定点[3];另外,癌性发热与癌症患者晚期、体能状态差和对免疫治疗的反应性降低密切相关[1]。同时研究发现青蒿鳖甲汤对各种原因不明的发热和慢性疾病、血液病、肿瘤、术后消耗性发热有显著疗效, 因此在治疗癌性发热方面也有巨大的潜力。

本研究显示青蒿鳖甲汤可以对癌性发热的治疗产生作用,其机制涉及多种活性成分,通过多个基因靶点及活性通路发挥作用。由Cytoscape 3.9.1软件中degree值大小得出青蒿鳖甲汤中以槲皮素、山奈酚、木犀草素、淫羊藿素为主要活性成分,起到了重要的药理作用。

槲皮素是一种多酚类黄酮化合物,具有抗癌、抗炎、抗氧化等多种作用。体内外试验均表明槲皮素可通过抑制血管生成和转移进展、改变细胞周期进程等方式发挥抗肿瘤作用;此外,槲皮素也能起到很强的抗炎作用,可通过抑制细胞因子的释放,减少COX和LOX的产生,维持肥大细胞的稳定从而减少炎性反应过程[4]。山奈酚也具有多种药理学特性,包括抗炎、抗肿瘤、抗氧化、心脏保护和抗菌等作用,它已被证实可以调节各种癌症相关的过程和活动,如细胞周期、氧化应激与细胞凋亡、增殖、转移等,也被认为是一种有效的促炎分子抑制物。木犀草素已被证明可以调节参与癌症发展的不同信号通路,有助于一系列生物过程的启动,包括细胞凋亡、细胞周期捕获、抗血管生成、抗炎等,并专注于表皮、血小板衍生和成纤维细胞发育因子的抗癌活性[5]。

根据PPI网络图的构建、GO及KEGG通路富集分析,笔者发现青蒿鳖甲汤治疗癌性发热的重要预测靶点包括VEGFA、CASP3、AKT1、MMP9、TNF、HIF1A、EGF、TP53、PTGS2、IL6等靶点,同时也可能通过TNF、IL-17、PI3K-Akt信号通路等治疗癌性发热。

VEGFA是肿瘤血管生成的主要激动物,被发现在大多数肿瘤中高表达,因此,VEGFA靶向药物研究已被作为抗癌疗法的重要方向[6]。CASP3在调节生物细胞和组织的生长和稳态维持中起着关键作用,也在执行细胞凋亡和致癌作用中有着重要意义[7]。IL-17是一种限制性非冗余细胞因子,严格控制IL-17介导的信号传导对于支持和维持免疫稳态至关重要,且IL-17在炎性反应、癌症和自身免疫性疾病中都有着重要的病理生理作用[8]。TNF是一种多功能细胞因子,是一种促炎细胞因子,也与自身免疫性疾病密切相关,它可以通过激活其广泛表达的TNF受体1来诱导炎性反应、细胞凋亡和坏死性凋亡,还可诱导细胞存活和增殖[9]。PI3K-Akt通路也是细胞周期过程中重要的细胞内信号通路,影响着多种细胞和生理过程,包括细胞生长、分化、存活、凋亡、代谢、血管生成和迁移等,在肿瘤治疗中有重要意义[10]。

综上所述,本研究通过借助网络药理学对青蒿鳖甲汤治疗癌性发热的作用机制方面进行了初步探索,研究发现青蒿鳖甲汤中有多种有效成分可能通过作用于VEGFA、CASP3、AKT1、MMP9、TNF、HIF1A、EGF、TP53、PTGS2、IL6等靶点进而调控TNF、IL-17、PI3K-Akt等通路发挥其治疗癌性发热的作用,为青蒿鳖甲汤的应用提供了理论基础,但还需借助更多的实验研究进一步深入探索。

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