乌梢蛇和金钱白花蛇中43种无机元素含量差异及判别分析

洪家顺 邹艺荣 王裕成 李道成 彭思思

江西省道地药材质量评价研究中心，南昌 330029

乌梢蛇为游蛇科动物乌梢蛇Zaocys dhumnades（Cantor）的干燥体；金钱白花蛇为眼镜蛇科动物银环蛇Bungarus multicinctusBlyth 的幼蛇干燥体[1]，药理研究表明，二者具有祛风、通络、止痉[2]、抗炎镇痛功效[3,4]，用于治疗早期类风湿关节炎[5]、麻木拘挛、中风口眼 斜、半身不遂、抽搐痉挛、破伤风、麻风、皮肤瘙痒症的治疗[6]。由于疗效明显，且资源非常有限，以至于蛇药材价格昂贵，此外，蛇药材常以干燥体或粉末入药，失去原本形状，仅凭肉眼难以辨别真假，导致不法分子以假乱真现象层出不穷，严重影响药物的有效性和安全性。为了有效区分金钱白花蛇和乌梢蛇与其它伪冒产品，学者们进行了大量研究，建立了鉴别乌梢蛇的方法有PCR 法、鳞片微形态、微性状、HPCE指纹图谱[7-11]。鉴别金钱白花蛇的方法有PCR 法、HPCE 指纹图谱和DNA 条形码技术[7,12，13]，但以无机元素为指标的研究很少。

根据无机元素含量的差异，可以有效辨别中药材的种类和产地，已被广泛应用于谷物、大米、大豆、甜瓜、西瓜、蜂蜜、牛奶、马铃薯、芸豆，水产品，茶叶，中药材等[14-18]。然而对研究乌梢蛇和金钱白花蛇中无机元素以及利用无机元素辨别蛇药品的研究鲜有报道。实验以金钱白花蛇、乌梢蛇及其炮制品为研究对象，利用ICP-MS 和ICP 测定了样品中43 种无机元素含量，比较分析不同蛇种类及炮制后样品的元素含量特征，结合主成分分析、正交偏最小二乘判别分析、线性判别分析，建立蛇样品的无机元素指纹图谱和样品种类判别模型，以期为金钱白花蛇和乌梢蛇的识别、质量安全控制提供参考。

1 仪器与材料

1.1 材料试剂

（Al、As、B、Ba、Be、Bi、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Ga、Li、Mg、Mn、Ni、Pb、Sb、Sn、Sr、Ti、Tl、V、Zn）多元素标准溶液（批号：GSB04-1767-2004，100μg∕mL）,Rb（批号：GSB 04-2836-2011，1000μg∕mL），Mo（批号：GSB G 62035-90，1000μg∕mL），Cs〔批号：GSB 04-1724-2004（b）〕单元素标准溶液；Mg 标准溶液〔批号：GSB 04-1735-2004（b）,1000μg∕mL〕；Fe 标准溶液（批号：GSB 04-1726-2004,1000μg∕mL）；Al 标准溶液（批号：GSB 04-1713-2004,1000μg∕mL）；Zn 标准溶液（批号：GSB 04-1761-2004,1000μg∕mL）；采购于国家有色金属及电子材料分析测试中心；Se（批号：22101835，1000μg∕mL）、Ge（批 号：22072635,1000μg ∕mL）、In（批 号：21122035,1000μg∕mL）采购于国家钢铁材料测试中心；UP 级硝酸（苏州晶锐化学试剂公司），实验用水为一级水。

金钱白花蛇和乌梢蛇药材信息详见表1。

表1 样品信息表Table 1 Sample information table

1.2 主要设备

ETHOS UP微波消解仪和赶酸器（北京莱伯泰科）及赶酸器VB48 UP；ICAP RQ 电感耦合等离子体质谱（美国赛默飞）；ICAP 7400 型全谱直读电感耦合等离子体发射光谱仪（美国赛默飞）；XSR205DU∕A 型电子天平（梅特勒-托利多），DHG-9240A 型台式电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒），Pulverisette 11 刀式研磨仪（德国Fritsch）。

2 分析方法

2.1 实验方法

准确称取0.5g（精确至0.1mg）烘干2h的蛇样品粉末于聚四氟乙烯消解罐中，缓缓加入5mL硝酸后，预消解过夜，根据预先设定的程序进行微波消解。试样消解完成后，自然冷却至室温后取出，将消解液转入50mL容量瓶中，用少量水润洗消解罐3次，洗涤液合并于容量瓶中,超纯水定容至刻度,摇匀，即得（如有少量沉淀，必要时离心分取上清液）。同法制备试剂空白溶液。

2.2 方法的线性与检出限

在仪器状态稳定下测定制备好的混合标准溶液，Mg、Fe、Al、Zn采用ICP测定，其他元素采用ICP-MS测定,结果见表2，各元素相关系数在0.997～1.000，表明线性关系良好。

表2 各元素线性方程、相关系数及检出限Table 2 Linear equation,correlation coefficient and detection limit of each element

2.3 精密度和加标回收实验

2.3.1 精密度试验。按照设定的检测方法进行测定，平行测试6 次，计算42 种无机元素峰强度的RSD 为0.8%～5.0%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验。取同一批蛇供试品进行6次平行测定，计算得到42种无机元素峰强度的RSD 为2.9%～8.1%，表明该方法重复性良好。

2.4 数据分析

采用EXCEL 2010 软件对不同蛇样品无机元素含量的原始数据进行分析，采用Origin 2022、SPSS 27.0和TBtools软件进行统计分析和绘图。

3 分析结果

3.1 元素含量特征

将处理好的乌梢蛇和金钱白花蛇样品，按照预先建立的检测方法进行测试，结果见表3。

由表3 可知，所测无机元素中，Be 在金钱白花蛇和乌梢蛇中均未检出；金钱白花蛇及酒炒金钱白花蛇中元素含量较高的为Mg（1378.8～1474.5mg∕L），Zn（131.9～143.3 mg∕L），Ti（98.2～115.6 mg∕L），Fe（48.8～372.7mg∕L），Sr（36.4～39.9 mg∕L），Al（19.6～36.7 mg∕L），Rb（11.9～13.8 mg∕L）；乌梢蛇及酒乌梢蛇中元素含量较高的为Mg（1530.1～2100.8mg ∕L），Zn（126.3～169.8mg∕L），Ti（179.4～297.7 mg∕L），Fe（59.0～171.2 mg∕L），Sr（45.036～78.3 mg∕L），Al（19.0～26.2 mg∕L），Rb（2.8～5.7 mg∕L）；酒炒金钱白花蛇中Fe（均值319.5mg∕L）含量较金钱白花蛇中Fe 含量（均值56.7mg∕L）明显增加，酒乌梢蛇中Ti（均值174.3mg∕L）含量较乌梢蛇中Ti（均值272.7mg∕L）含量明显降低。

3.2 无机元素图谱

由于蛇样品中42 种无机元素（Be 未检出，以下分析中除去）含量数量级差别较大，为了比较直观准确地绘制质量分数分布无机元素图谱，将不同元素的含量扩大或缩小至同一数量级，其中Cd、Ga、Tl、Bi 扩大1000倍，Li、Ni、Zr、V、Mo、Sn、Cs、Co、Mo、Sb、Co、Fe、Al扩大100 倍，Cr、Tb、Ho、Tm、Yb、Zn、Eu、Er、Lu 扩大10倍，Ba缩小10倍，Ti缩小100倍，然后以元素种类为横坐标，相对含量为纵坐标，得到42 种元素相对质量分数分布曲线图（见图1）。17 批蛇样品峰形相似，因种类和炮制的因素，相对含量有差异，但其谱线的形状及走势具有较高的相似性。

图1 无机元素图谱Figure 1 Inorganic element map

3.3 主成分分析

主成分分析是多元统计中一种数据挖掘技术，它能在不丢失主要变量信息的条件下选择位数较少的新变量代替数量较多的原始变量，排除众多化学信息共存中相互重叠的信息，降低了繁琐数据的维数[19]。为研究无机元素与蛇样品之间的相关性，采用SPSS 27.0 进行主成分分析。结果显示，第1 主成分的方差贡献率是40.29%，其它四个主成分的方差贡献率分别是20.25%、11.49%、8.08%和4.27%，累计方差贡献率为84.38%，表明前5个主成分代表了原始指标大部分的信息。如图2 所示，第一主成分主要综合了Rb、Cs、Se 的信息，第二主成分La、Y、Nd、Pr、Gd、Sm 的信息，第三主成分主要综合了Mo、V的信息，第四主成分主要综合了Lu、Tm 的信息，第五主成分主要综合了Ni、As 的信息。为了较为直观的分析，以前三个主成分得分绘制了3D 散点图（见图3），从图中可知，除S2和S4 外，金钱白花蛇和酒炒金钱白花蛇聚集在一起，而乌梢蛇和酒乌梢蛇均有各自的聚类趋势。这与聚类热图分析的结果一致。结果说明乌梢蛇、酒乌梢蛇可以完全区分，而对于金钱白花蛇和酒炒金钱白花蛇的区别需要进一步判别。

图2 主成分的特征向量雷达图Figure 2 Eigenvector Radar Diagram of Principal Components

图3 PCA得分三维图Figure 3 Three-dimensional plot of PCA score

3.4 正交偏最小二乘判别分析

运用SIMCA-P 14.1 软件对17 批蛇样品无机元素含量进行正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），建立的模型R2X=0.641，R2Y=0.843，Q2=0.668，均大于0.5，表明该模型稳定、可靠。为了进一步验证该判别模型的可预测性，进行了200 次模型置换交叉检验（图4B）。置换检验的R2=0.336，Q2=-0.521，表明该模型没有过拟合现象（R2＜0.5，Q2＜0），具有统计学意义。利用OPLS-DA 模型的第1、2主成分得分绘制散点图，如图4A 所示，17 批蛇样品聚为三簇。金钱白花蛇和酒炒金钱白花蛇处于第一；四象限、乌梢蛇处于第二象限；酒乌梢蛇处于第三象限。结果表明，从蛇的种类来说，OPLS-DA法可以很好的区分金钱白花蛇和乌梢蛇。经过炮制后，乌梢蛇和酒乌梢蛇聚集明显且样品点没有重叠，仍然有较好的区分；金钱白花蛇和酒炒金钱白花蛇虽然没有重叠但较为聚集，不能有效辨别，这与主成分分析结果一致。各元素VIP分值和荷载图如图4C和图4D，各元素VIP 分值和荷载图如图4C和图4D，VIP值对组间差异的影响大，可以作为筛选组间特征性成分的指标。以VIP＞1 为标准，得到24种元素（Fe、V、Lu、Cd、Co、Yb、Tm、Eu、Ba、Cu、Al、Cs、Zn、Mo、Rb、Sr、Mg、Ti、Bi、Ga、Se、As、Ho、Tb）在不同批次蛇中具有显著差异。由荷载图可知，以上24种元均距离远点距离较远，表明这24种元素可以作为区分金钱白花蛇和酒炒金钱白花蛇、乌梢蛇和酒乌梢蛇的特征元素。

图4 不同批次蛇偏最小二乘判别分析，（A）得分图；（B）排列实验验证结果；（C）无机元素VIP值分布图；（D）荷载散点图Figure 4 OPLS-DA of different batches of snakes,(A)Score plot;(B)The results of permutation experiments;(C)Distribution of VIP values for mineral elemental;(D)Loading scatter plot

3.5 线性判别分析

线性判别分析属于有监督的判别分析方法，以投影后类内方差最小，类间方差最大的原则对数据进行降维，从而实现样品的分类[19]。为了进一步考察各无机元素含量对四类蛇样品的判别情况，以42种无机元素作为判别分析的自变量，对蛇样品进行进行逐步判别分析，筛选出Mo、Sb、Fe、Co、Rb、Mg、Cs、Tl、La、Gd、Tm共11种对蛇种类判别显著的元素被引入到判别模型，构建了3个典型判别函数。Willks'Lambda 的检验结果进一步证实，在α=0.05 的显著性水平下，3 个判别函数对分类效果均为显著，表明判别模型拟合率可接受。判别函数F1、F2 和F3 解释了100%变异（F1、F2 和F3 分别解释了变异的96.9%、2.7%和0.4%），典型相关系数均在0.99 以上，其中函数F1 对蛇的分类占主要贡献作用。判别函数如下所示：

式中ωMo、ωSb、ωFe、ωCo、ωRb、ωMg、ωCs、ωTl、ωLa、ωGd、ωTm代表蛇中Mo、Sb、Fe、Co、Rb、Mg、Cs、Tl、La、Gd、Tm的质量分数。

以F1、F2 和F3 得分值绘制散点图（见图5），由图5 可知，金钱白花蛇、酒炒金钱白花蛇、乌梢蛇和酒乌梢蛇有独特的空间分布特征，4种蛇样品无重叠现象，能够有效的区分。利用回代检验和留一交叉验证两种方法对LDA判别模型进行验证，判别分析结果如表4 所示，不同种类蛇样品回代检验和留一法交叉检验的总体判别正确率均为100%，说明以Mo、Sb、Fe、Co、Rb、Mg、Cs、Tl、La、Gd、Tm 11 种无机元素构建的判别模型可以有效的区别出不同品种的蛇类。4 种蛇的Fisher线性判别函数如下所示：

图5 4种蛇样品LDA得分散点Figure 5 Scatter points of LDA scores for four snake samples

表4 4种蛇样品判别分析分类结果Table 4 Discriminant analysis and classification results of four snake samples

4 结论

通过分析蛇样品中43种无机元素的含量，发现金钱白花蛇、酒炒金钱白花蛇、乌梢蛇及酒乌梢蛇中元素含量较高的均为Mg，Zn，Ti，Fe，Sr，Al，Rb；乌梢蛇中Cu、Ti 含量高，Zn 含量低，酒乌梢蛇中V、As、Mo、Cd、Sb、Co、Sr、Ba 含量高；金钱白花蛇中Lu 含量高，酒炒金钱白花蛇中Ga、Fe、Al 含量高；不同蛇样品无机元素含量具有各自的特征。运用无机元素指纹图谱、主成分分析、正交偏最小二乘判别分析和线性判别分析对4种蛇样品进行判别分析。主成分分析可以完全区分乌梢蛇和金钱白花蛇，乌梢蛇和酒乌梢蛇，无法完全区分金钱白花蛇和酒炒金钱白花蛇。OPLS-DA 模型可以完全区分金钱白花蛇和乌梢蛇，乌梢蛇和酒乌梢蛇，而对金钱白花蛇和酒炒金钱白花蛇辨别度低；基于Mo、Sb、Fe、Co、Rb、Mg、Cs、Tl、La、Gd、Tm 11 种无机元素的线性判别模型有效的区分4 种蛇样品，回代检验和留一叉法交叉检验的整体正确判别率均为100%。实验仅对金钱白花蛇、酒炒金钱白花蛇、乌梢蛇和酒乌梢蛇进行了初步研究，研究结果的普适性任然需要多批次种类样本的支撑，从而建立更加精准、稳定、实用的蛇分类判别模型，为蛇的真伪、分类判别提供基础数据和技术支撑。