基于非靶向液-质联用探究杜仲啤酒的有效成分

王雷 唐秋梅 黄宝纯 刘宇凡 杨光勇 何光志

自啤酒进入我国后，其市场份额呈现爆发式增长，在促进经济增长的同时，也被大多数人接受和喜爱。然而，随着生活节奏日益加快和工作压力持续增长，人们的饮酒率持续上涨，由于过度饮酒导致的消化道疾病、心血管疾病等也日益增加，因此可利用一些具有保健功能的藥材，研发出保健型啤酒以替代普通啤酒。中药杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）具有补肝肾、强筋骨、安胎的功效，临床多用于肝肾不足、腰膝酸痛、筋骨无力、头晕目眩等症状。本研究结合中药杜仲的优势和啤酒的特点，利用杜仲研制出保健型啤酒，再利非靶向液-质（LC-MC）联用对杜仲啤酒进行成分鉴定与分析，以期为杜仲啤酒的开发提供一定的实验依据。

一、原料与设备

1.原料。浅色小麦（德国）、S-33型酵母（德国）、啤酒花（美国）、杜仲（毫州市任大兰药业有限公司）、雪花啤酒（华润雪花啤酒有限公司，批号为QS510015030230）。

2.主要试剂。甲醇（67-56-1，≥99.9%，Thermo）；乙腈（75-05-8，≥99.9%，Thermo）；2-氯苯丙氨酸（103616-89-3，98.5%，Aladdin）；甲酸（64-18-6，≥98%，TCI）；甲酸铵（540-69-2，≥99%，Sigma）；H2O（7732-18-5，100%，Milli-Q）。

3.仪器及设备。电子分析天平（EL104，梅特勒-托列多有限公司）；恒温水浴锅（HH-42（0），苏州威尔实验用品有限公司）；离心机（Sorvall Legend 21R，美国Thermo Fisher公司）；糖化锅（WS-38，广州伟纳斯不锈钢实业有限公司）；发酵罐（800mL，烟台帝伯仕自酿有限公司）；高压灭菌锅（YA28X6T，宁州甬安医疗器械制造公司）；生化培养箱（LRH-150-Ⅱ，广东医疗器械）；麦芽汁糖度计（1.0-1.1，烟台帝伯仕自酿有限公司）；pH计（HI2215，哈纳仪器（北京）有限公司）；电磁炉（WLK-T1，广州半球实业有限公司）；冷冻离心机（H2050-R，湘仪）；混匀仪（QL-866，其林贝尔）；真空浓缩仪（5305，Eppendorf）；滤膜（0.22?m PTFE，津腾）；冷冻干燥机（SCINTZ-10N，新芝）；液相色谱仪（Ultimate300，Thermo）；质谱仪（Q Exactive Focus，Thermo）。

二、实验与方法

1.杜仲啤酒的制备。（1）制备麦芽汁。粉碎小麦时加入少量水使小麦润湿，且粉碎不宜过细。按料液比1：4，于37℃下自然浸泡30min，直接升温至55℃进行蛋白休止30min，然后转移到糖化锅中，缓慢升温至65℃-78℃进行糖化（60min）。结束糖化后进行过滤，将滤液煮沸后加入啤酒花（啤酒花总量按40-60mg/L计算）。煮沸后先加入10%的啤酒花；煮沸60min后加入50%的啤酒花总量；煮沸90min后加入余下的啤酒花，继续煮沸10min，除去表面的浮沫。用冷却盘快速冷却，使温度快速降到25℃以下。将煮沸冷却后的麦芽汁沿一个方向搅拌旋转，使蛋白沉积在底部，静置10min备用。

（2）前发酵。将杜仲粉加适量水浸泡30min，加入8倍量的水煮沸30min，过滤，滤液备用。将药渣再加入4倍量的水煎煮20min，再进行过滤，药渣重复上一步操作，合并三次滤液并浓缩。将浓缩液加入煮沸后的麦芽汁中，加入5%的啤酒酵母，充氧，密封，在12℃条件下进行前发酵。

（3）后发酵。前发酵结束后，将前发酵液得到的新鲜嫩啤酒进行低温离心，将上清液转移至灭菌后的啤酒瓶中，再进行封瓶与灭菌。将发酵温度由12℃以每天1℃的速度进行升温，直至温度达到20℃时停止升温。常温保存，可得熟化后的啤酒。

2.感官检测。参照啤酒感观评价的研究、啤酒分析方法，设置感官评价项目（表1），包括4大项内容，总分100分，随机抽取20名校内人员进行品评（得分用±SD表示）。

3.理化指标检测。根据GB/T 4928-2008《啤酒分析方法》的要求，对本研究制备的啤酒进行感官要求（外观、口感、泡沫）及原麦芽汁的浓度、酒精度数、酸度等理化指标的检测，根据结果对啤酒质量进行优级评定。

4.非靶向液-质联用物质分析。（1）检测样本预处理。精确移取适量样本于2mL离心管中，浓缩干燥；加入500?L甲醇溶液（-20℃保存）到干燥后的样本管中，涡旋1min；12000rpm、4℃离心10min，取全部上清液，转移至新的2mL离心管中，浓缩干燥；准确加入150?L 80%甲醇水配制的2-氯-L-苯丙氨酸（4ppm）溶液（-20℃保存）复溶样品，取上清液过0.22?m膜过滤，过滤液加入到检测瓶中，用于LC-MS检测。

（2）上机检测。①色谱条件。使用Thermo Vanquish（Thermo Fisher Scientific，USA）超高效液相系统，色谱柱为ACQUITY UPLC? HSS T3（2.1×150mm，1.8?m）（Waters，Milford，MA，USA），流速为0.25mL/min，柱温为40℃，进样量为2?L。正离子模式，流动相为0.1%甲酸乙腈（C）和0.1%甲酸水（D），梯度洗脱程序为：0-1min，2%C；1-9min，2%-50%C；9-12min，50%-98%C；12-13.5min，98%C；13.5-14min，98%-2%C；14-20min，2%C。负离子模式，流动相为乙腈（A）和5mM甲酸铵水（B），梯度洗脱程序为：0-1min，2%A；1-9min，2%-50%A；9-12min，50%-98%A；12-13.5min，98%A；13.5-14min，98%-2%A；14-17min，2%A。②质谱条件。Thermo Q Exactive Focus质谱检测器（Thermo Fisher Scientific，USA），电喷雾离子源（ESI），正离子喷雾电压为3.50kV，负离子喷雾电压为-2.50kV，鞘气为30arb，辅助气为10arb，毛细管温度为325℃，分辨率70000进行一级全扫描，一级离子扫描范围为m/z81-1000。采用HCD进行二级裂解，碰撞电压为30%，二级分辨率为17500，采集信号前3离子进行碎裂，同时采用动态排除去除无必要的MS/MS信息。

（3）数据处理。通过Proteowizard軟件包中的MSConvert工具，将原始质谱raw文件转换为mzXML文件格式。采用RXCMS软件包进行峰检测、峰过滤、峰对齐处理，得到物质定量列表，参数设置为bw=2，ppm=15，peakwidth=c（2，15），mzwid=0.015，mzdiff=0.01，method=“centWave”。采用公共数据库HMDB6、METLIN、massbank、LipidMaps、mzclound、KEGG及自建物质库进行物质的鉴定，参数设置为ppm＜20ppm。基于QC样本的LOESS信号校正方法实现数据矫正，消除系统误差。在数据质控中，过滤掉QC样本中RSD＞30%的物质。

三、结果与分析

1.麦芽发酵液。糖化过滤后得到橙黄色麦芽汁，测得其麦芽汁浓度为11°P。在前发酵期间，第3d后开始进入高泡期，7d后泡沫消失，10d后得到新鲜嫩啤酒，如图1所示。

图1：麦芽发酵液

2.后发酵。经过后发酵后，啤酒的整体颜色呈现淡黄色或淡棕色，接近于杜仲药材提取液的颜色，如图2所示。

图2：后发酵液

3.感官检测结果。根据GB/T 4928-2008中对啤酒感观的要求，随机抽取20名校内人员进行品评（得分用±SD表示），总得分为83.95±4.90，表明本研究制备的杜仲啤酒符合浓色啤酒的规定，详见表2。

4.理化指标检结果。对照GB/T 4928-2008中的啤酒理化指标要求，本实验制备的杜仲啤酒符合浓色啤酒的规定要求，其质量优级为3.7，详见表3。

5.鉴定结果。通过液质联用（LC-MS）方式进行物质鉴定检测，最终鉴定出543个代谢物，其中包含黄酮类、绿原酸、新绿原酸、桃叶珊瑚苷等成分，详见表4。

四、讨论与结论

经LC-MS方法检测得出，杜仲啤酒中含有槲皮素、绿原酸、桃叶珊瑚苷等成分。研究证明，槲皮素在高血压、糖尿病、心血管疾病等治疗方面发挥作用，通过调控炎症信号通路减轻肝组织损伤来发挥免疫作用，改善三氯化铁诱导颈动脉损伤引起的血流减慢来抗血小板，防止血栓形成，减少血管弹性来降低血压，从而改善心功能，防止心肌缺血。作为植物体内的一种有机化合物，绿原酸是植物细胞经过有氧呼吸合成的次生代谢产物，具有降压、抗菌等多种药理性功能。作为一种天然的环烯萜苷化合物，桃叶珊瑚苷是杜仲的有效成分之一，具有抑制氧化应激反应、炎症反应等功能。

综上所述，高血压、糖尿病、心脏病的发病机制广泛，且与日常生活饮食息息相关，常规啤酒的成分、酒精含量等可能会刺激神经系统和血管扩张，增加疾病的恶化进程。而杜仲啤酒中的活性成分可以在缓解压力的同时从源头对疾病进行调控，整体调节身体机能。与传统的杜仲浸泡酒相比，本研究制备的杜仲啤酒口感更佳，刺激性更小，适用人群更为广泛。

基金项目：2020年贵州中医药大学药食两用类中药啤酒研究中心。

作者简介：王雷（1998-），男，大学本科，研究方向为制药工程。

*通信作者：何光志（1977-），男，博士，教授、硕士生导师，研究方向为中西医结合。