QuEChERS-超高效液相串联质谱法同时测定蜂蜜中硝基咪唑类药物残留

刘兰霞 解迎双 寇宗红 王波

为了治疗和预防孢子虫病在蜜蜂群体间的传播，降低蜜蜂的死亡率，硝基咪唑类药物曾被广泛应用于蜜蜂养殖过程中。但硝基咪唑类药物的违用、滥用和误用现象导致蜜蜂体内产生药物残留，并以蜂蜜为媒介进入人体，对人体造成致癌、致畸、致突变作用和遗传毒性损害，因此各国已相继禁止硝基咪唑类药物在动物源性食品中的使用。

目前，检测硝基咪唑类药物残留的方法主要有气相色谱质谱法、液相色谱法等。本研究建立了QuEChERS-超高效液相串联质谱法，以检测蜂蜜中多种硝基咪唑类药物的残留，对维护食品安全、保障消费者身体健康具有重要意义。

一、仪器与方法

1.仪器与设备。高效液相色谱仪，美国沃特世公司；多管涡旋振荡器，深圳逗点生物技术有限公司；低温冷冻高速离心机，德国Sigma公司。

2.试剂与材料。甲醇、乙腈、甲酸、氨水（色谱纯），德国默克公司；丙基乙二胺（PSA）粉末、十八烷基键合硅胶（C18）粉末、石墨化炭黑（GCB）粉末，美国安捷伦公司；无水硫酸镁、无水氯化钠，国药集团化学试剂有限公司；超纯水，本实验室纯水仪制备；32种硝基咪唑类化合物（纯度＞99%），德国Dr.Ehrenstorfer公司；蜂蜜，购自当地农贸市场或超市，于-20℃冷冻保存，待用。

3.标准溶液配置。（1）标准储备液（浓度100mg/L）。精密称取32种硝基咪唑类化合物0.01g，用甲醇溶解后，定容至100mL容量瓶内，配制成质量浓度为100mg/L的单标准储备溶液，置于-20℃冰箱中保存6个月。

（2）混合标准工作液（浓度1mg/L）。精密量取濃度为100mg/L的上述标准溶液100μL于100mL容量瓶中，用甲醇-水（8∶2）定容，于4℃保存。

4.样品前处理。（1）提取。准确称取5.00g（精确至0.01g）蜂蜜样品于50mL具塞离心管中，加入5mL水，涡旋5min，使其充分混匀。加入10mL 0.1%氨水-乙腈，涡旋提取5min，超声提取10min。加入2g氯化钠涡旋1min，加入4g无水硫酸镁涡旋3min，于4℃、12000r/min离心5min。准确移取上清液5.00mL于另一15mL离心管中，于30℃氮气吹浓缩至近干，待复溶，净化。

（2）净化。加入1.00mL乙腈复溶，依次加入50mg PSA、50mg C18、150mg MgSO4涡旋混合1min，以12000r/min离心5min，取上清液于30℃下氮气吹至近干，加入1.00mL 80%甲醇-水溶液复溶，涡旋混合1min，过0.22μm滤膜于进样瓶中，上机检测。

5.仪器条件。（1）色谱条件。色谱柱：C18色谱柱（100mm×2.1mm 2.7μm）；柱温：25℃；流速：0.2mL/min；进样量：5μL；流动相：A为甲醇溶液，B为水溶液；梯度洗脱程序：0-5min（5%-10% A），5-20min（10%-40% A），20-25min（40%-90% A），25-26min（90%-5% A），26-30min（5% A）。

（2）质谱测定条件。离子源：ESI源；采集模式：正离子模式；扫描方式：多反应监测（MRM）；毛细管电压：3.2kV；离子源温度：150℃；脱溶剂温度：350℃；脱溶剂气流速：500L/Hr；锥孔气流速：50L/Hr；碰撞气（氮气）流速：10μL/min；其他MRM参数见表1。

二、结果与讨论

1.样品提取方式的选择。本实验在考察了称取样品后，采用了直接加提取试剂提取、用水溶解后再提取试剂两种方法对蜂蜜样品进行预处理。结果表明：采用第一种方法，硝基咪唑类化合物的回收率较低，在45%-60%；第二种方法的回收率较高，为70%-110%。

2.提取溶剂的选择。本实验考察了乙酸乙酯、0.1%乙酸乙腈、0.1%甲酸乙腈、0.1%氨水乙腈（V/V）4种提取溶剂的提取效果，见图1。根据图1可知，选用乙酸乙酯作提取溶剂时，后期盐析效果较差，会影响实验的回收率，甲硝唑、哌莫硝唑、帕硝唑、卡硝唑、非昔硝唑的回收率均小于40%；选用0.1%乙酸乙腈作为提取溶剂时，帕硝唑、非昔硝唑的回收率小于30%；选用0.1%甲酸乙腈作为提取溶剂时，哌莫硝唑、帕硝唑、特尼哒唑、非昔硝唑的回收率均小于20%，米索硝唑的回收率高达140%；选用0.1%氨水乙腈作为提取溶剂时，硝基咪唑类化合物的回收率在71.90%-105%，符合方法学考察的要求，因此本研究选择0.1%氨水乙腈作为提取溶剂。

3.提取条件的选择与优化。本实验采用超声提取法、涡旋法、超声提取法与涡旋法组合提取三种方式进行对比实验。实验条件分别为：超声提取：5min、10min、15min；涡旋：3min、5min、10min；超声与涡旋组合方式：5+3min、5+5min、5+10min、10+3min、10+5min、10+10min、15+3min、15+5min、15+10min。以硝基咪唑类化合物的回收率为指标，选择最优实验方案，实验结果见图2。根据图2可知，单一的超声、涡旋提取方式下硝基咪唑类化合物的回收率均小于组合式。在超声+涡旋的组合方式中，蜂蜜在超声5min时易产生大量泡沫，会影响下一步实验的准确性及最终结果的回收率；随着超声时间的增加，泡沫会逐渐减少。最后以涡旋5min、超声提取10min为组合的提取方式为最优实验方案，硝基咪唑类化合物的回收率在72%-110%。

三、结论

本实验通过对色谱柱、流动相等色谱条件进行优化，以0.1%氨水乙腈为提取溶剂，采用涡旋震荡-超声联合提取法进行提取，使用PSA、C18、GCB、MgSO4进行净化，建立了QuEChERS-UPLC-MS/MS法，同时检测了蜂蜜中多种硝基咪唑类药物的残留。该方法简单、快速、准确，灵敏度高、准确性好，有效降低了目标化合物的基质干扰，增加了同时检测硝基咪唑类原药的数量，可为蜂蜜样品的质量评价研究提供理论基础。

基金项目：甘肃省市场监督管理局科技计划项目：“基于机器学习算法对靖远羊肉元素的分析及风险评估模型的建立”（SSCJG-SP-A202306）。

作者简介：刘兰霞（1968-），女，汉族，甘肃白银人，大学本科，研究方向为食品安全检测。

*通信作者：王波（1982-），男，汉族，甘肃陇南人，博士，研究方向为食品安全检测和药物学分析。