叶绿素提取实验中无水碳酸钠作用初探

王国贤 吴红胜 李胜杰

(1.广东省深圳市第二高级中学 2.华中师范大学第一附属中学 3.长江大学)

在2019版人教版高中生物教材“绿叶中的色素提取和分离”实验中,材料用具提供的是无水乙醇,同时括号中注明:也可用体积分数95%的乙醇加入适量无水碳酸钠来代替。为何用95%的乙醇作为提取剂时要建议加入无水碳酸钠呢?加入和不加入无水碳酸钠的差别有多大?笔者通过查阅相关资料和开展具体实验,对上述问题作如下研究。

1.叶绿素结构、性质及提取原理分析

绿色植物含有大量的叶绿素a和叶绿素b,在蓝细菌中还含有叶绿素c和叶绿素d。叶绿素分子主要是由4个吡咯环连接形成的卟啉环大环构成,此外还有1个副环结构,镁离子位于大环中央,叶绿醇尾与Ⅳ吡咯环上的丙酸连接,构成完整的叶绿素分子。不同种类叶绿素分子其取代基或双键类型不同。

其长链疏水的叶绿醇尾结构是叶绿素分子溶于乙醇、丙酮、石油醚等有机溶剂,而不溶于水的原因,同时也是叶绿素分子能够分布于由磷脂分子构成的类囊体薄膜上的原因。类胡萝卜素同样不溶于水,但能溶于有机溶剂。

分离叶绿素等色素正是利用这些色素分子能够溶于有机溶剂而不溶于水的原理,将色素与其他物质分离开。通过研磨破坏细胞内部结构,释放出色素后,色素溶于乙醇等有机溶剂,再过滤掉残渣,就能得到粗提取的色素。同样,层析时所用试剂也须是有机溶剂:不同色素在层析液中的溶解度不同,扩散速度不同,从而将色素分离。需要说明的是,并非所有的色素都是脂溶性色素,例如存在于液泡中的花青素就是水溶性色素,该色素的提取就不能使用有机溶剂。

由于乙醇和水能以任意比互溶,而色素不溶于水,因此当提取物中有水存在时,会降低叶绿素在酒精中的溶解度,进而影响提取效果。需要注意的是,由于细胞中含量最多的化合物是水,因而由于水的存在而导致的色素提取损失是不可避免的。同一株植物的不同叶片、叶片的不同位置,含水量均存在一定差异,提取效率也自然存在差异。依据该理论,加入无水碳酸钠除去部分水分有助于提高色素提取效果,但也有研究认为过量的碳酸钠很容易造成碱性过大,进而破坏色素分子。

2.不同教材和文献中叶绿素提取方法的比较

笔者比较了人教版、沪科版、北师大版、苏教版、浙科版高中生物教材(均为2019版),色素提取方法基本相同,除人教版中提出“可用体积分数95%的乙醇加入适量无水碳酸钠来代替”之外,其他教材均未提出这一观点。其中,浙科版教材与其他版本教材在色素提取方法上有较大差异。该教材所用提取试剂正是95%的乙醇,不同的是,其实验材料不是用新鲜叶片,而是将叶片烘干并粉碎成干粉后再进行提取。

笔者同时查阅了相关文献,有大量实验直接采用95%的乙醇作为叶绿素提取剂。此外,也有多种提取方法提取效果比较研究的文章,但未找到用过滤法提取色素,分别以无水乙醇、95%乙醇和95%乙醇+无水碳酸钠作为提取剂时,分析比较提取效果的研究文章。

3.不同提取剂提取色素含量的比较

为了弄清无水乙醇、95%乙醇、95%乙醇+无水碳酸钠三者在提取叶绿素时是否存在差异,笔者利用三种提取试剂,按照人教版高中生物教材提供的方法步骤,分别提取了菠菜叶片色素,并利用分光光度计检测并计算了叶绿素含量。

为了减少测量和计算误差,称取的叶片重量均控制在0.2 g左右,所选取的叶片位置和颜色相当,每种提取试剂做3个实验重复,共9组实验。利用不同试剂提取后分别定容至25 mL,再从25 mL中取5 mL稀释至25 mL,在波长665 nm和649 nm处测量各组提取液的吸光度,根据朗伯比尔定律,依据如下公式(Arnon公式修改而来)计算叶绿素浓度,并计算平均值。

叶绿素a含量=(13.95A665-6.88A649)25*5/(1000 m)

叶绿素b含量=(24.96A649-7.32A665)25*5/(1000 m)

其中:A665和A649是待测液在波长665 nm和649 nm处的吸光度,25为过滤所得溶液总量,5为稀释倍数,m为称取的叶片质量。所测结果如表和图所示。

不同提取剂提取的叶绿素含量(单位:mg/g)

不同提取剂提取的叶绿素含量(单位:mg/g)

通过表格数据和柱状图可以比较直观地看出,以无水乙醇和95%乙醇+无水碳酸钠作为提取剂时,两组在提取的叶绿素总量、叶绿素a含量和叶绿素b含量上差异不大,而只用95%乙醇作为提取试剂时,叶绿素含量(包括叶绿素a含量和叶绿素b各自含量)均较其他两组要低。

选取叶绿素a作为比较对象,通过t检验做差异分析,以无水乙醇和95%乙醇+无水碳酸钠作为提取剂时,两者叶绿素a含量之间无显著差异,以95%乙醇和95%乙醇+无水碳酸钠作为提取剂时,两者叶绿素a含量之间存在极显著差异(P<0.01)。

4.讨论

通过分析实验原理和进行具体实验,结果表明,添加无水碳酸钠的确有助于提高色素的提取效果。无论是95%的乙醇中的水,还是细胞中本身的水,都会造成叶绿素的损失,降低叶绿素的提取效果。

实验启示,在保证色素不被破坏的情况下,确实可以通过一定的方法(如浙科版教材采用的适当温度烘干、加入无水碳酸钠等)来减少水分对色素提取的影响。但事实上,95%的乙醇同样可以用来提取色素,而非某些教辅资料中所述“不能采用95%乙醇提取色素”。虽然与加入无水碳酸钠的95%乙醇提取剂相比,在提取效果上存在一定差异,但在高中色素层析实验中,可以通过多画几次滤液细线、加大叶片用量、选择更浓绿的叶片等方式来解决色素量稍低的问题。

需要说明的是,所用材料差异、实验操作、仪器设备以及公式本身都存在一定误差,高中生在实验操作中这些误差可能更大,此外“适量”无水碳酸钠的量也并不好把握。因此,为获取更好的提取效果,建议采用无水乙醇作为提取剂。