基于液质联用和网络药理学探讨天花粉防治糖尿病的作用机制

梁浩威 徐纯依 关旸 张卓文 张芮芹 吴成 王辉

中医药治疗糖尿病历史悠久，研究表明，天花粉主清热泻火、生津止渴，可用于预防和治疗内热消渴的糖尿病，对应症状以用药剂量治疗无毒副作用，常见于古今糖尿病方剂［1］。天花粉化学成分较为复杂，难以解析，在防治疾病过程更是涉及多种成分、靶点及途径，致使研究天花粉活性成分及作用机制存在较大难度［2］。液质联用作为一种先进的成分分析方法，凭借高分辨率和灵敏度可快速标记中药内化合物组成，广泛应用于中药化学领域［3］。而网络药理学在复杂成分和多个靶点的中药药理研究中具有独特的优势，可以系统研究中药防治疾病机制［4］。因此，本研究通过液质联用技术解析天花粉防治糖尿病的活性成分，并结合网络药理学和分子对接技术系统性探究其作用机制，以期为天花粉等中药防治糖尿病的临床应用提供科学依据和研究思路。

1 材料与方法

1.1 实验仪器 超纯水系统（Milli-Q IQ 7000，Merck KGaA）；500 mL套式恒温器（TC-15，新华医疗器械厂）；高分辨四级飞行时间串联液质联用仪（SYNAPT G2-Si，Waters）；旋转蒸发仪（RE-5298，上海荣亚生化仪器厂）。

1.2 实验材料 天花粉（批号220824）购自杭州方回春堂国药馆有限公司，为葫芦科栝楼属植物栝楼Trichosanthes kirilowii Maxim.的干燥根。甲醇（批号l1116707042）、乙腈（批号JB092530）购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。甲酸（批号H1913009）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。CORTECS UPLC T3 column色谱柱（2.1×100 mm，1.6 μm）和BEH C18 Van Guard保护柱（2.1×50 mm，1.7 μm）购自沃特世科技（北京）有限公司。

1.3 实验网站 SwissADME（www.swissadme.ch/）；Swiss Target Prediction（www.swisstargetprediction.ch/）；GeneCards数据库（www.genecards.org/）；STRING（cn.string-db.org/）；Metascape（metascape.org/）；UniProt（www.uniprot.org/）。

1.4 方法 （1）天花粉水提物制备：精密称取天花粉30.0 g，置于500 mL圆底烧瓶内，加入300 mL超纯水浸泡30 min。冷凝回流加热，煮沸1 h过滤，重复1次。冷却后合并2次滤液，浓缩至1.0 g生药/mL立即使用。天花粉水提液5.0 mL，超纯水和甲醇稀释为10 mg生药/mL（甲醇含量50%）的供试液，50%甲醇水溶液为对照液，3,000 r/min离心5 min取上清，0.22 μm滤膜过滤后用于液质联用检测。（2）色谱与质谱条件：①色谱条件：流动相：A溶剂（乙腈）；B溶剂（0.1%甲酸溶液）；流速：0.3 mL/min；梯度洗脱，柱温：25℃；进样量：2 μL。②质谱条件：电喷雾离子源（ESI）分别采用正负离子扫描模式；离子源温度：120℃；锥孔电压：20.0 V；毛细管电压：3.0 kV（+）、2.5 kV（-）；锁定质量溶液：Lockspray在线校正，亮氨酸-脑啡肽（Leueine-Enkephalin，［M+H］+=556.2771，［M-H］-=554.2615）；扫描模式为MSe；质量扫描范围：m/z 50～1,200 Da，扫描时间0.2 s；工作站：MassLynx V4.1工作站。（3）成分分析：将数据导入Unifi数据处理工作站，使用软件UNIFI 2.0分析色谱图及各色谱峰的质谱信息，分析天花粉水提物组分及结构，得到天花粉成分。（4）天花粉成分筛选：SwissADME为全面药物代谢性质分析网站，可依据药物代谢信息对活性成分进行筛选。将天花粉成分导入SwissADME网站，以肠胃道的吸收“GI absorption”为“High”，类药性“Druglikeness”中的Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge等5项根据Lipinski五原则，依据Yes的数量≥2个作为限制条件，筛选得到天花粉潜在活性成分。（5）药物靶点预测：将天花粉潜在活性成分导入Swiss Target Prediction中进行靶点预测，选择Probability不为0的靶点作为天花粉相关的药物靶点。（6）疾病靶点收集：在GeneCards数据库中以“diabetes”为检索词，检索得到糖尿病相关靶点，以中位数筛选法获取候选糖尿病相关的疾病靶点。（7）蛋白质互作（PPI）网络构建及核心靶点的筛选：将药物和疾病靶点做交集可得天花粉防治糖尿病潜在靶点。将交集靶点输入STRING网站中构建蛋白互作网络，设置物种为“Homo species”，置信度设置最高为0.90，导入Cytoscape 3.7.1软件中，筛选获得主要靶点，可视化绘制PPI蛋白互作网络图。采用Cytoscape软件的cytohubba插件以MCC算法筛选核心靶点。（8）相关靶点GO功能分析及KEGG通路富集分析：将潜在靶点导入Metascape网站中进行GO功能富集分析包括生物过程（biology process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞组成（cellular component，CC）及KEGG富集分析，选择“Homo species”，P value设置为0.01。获得富集分析结果后，用R 4.1.2软件的ggplot2包实现可视化，GO富集采用柱状图形式展示，KEGG富集以气泡图形式展示。（9）“成分-靶点-通路”网络图构建：根据蛋白靶点与KEGG信号通路之间的相互关系，选取关键通路，构建“成分-靶点-通路”网络，并用Cytoscape软件可视化为网络图。（10）分子对接：结合AutoDock Vina通过分子精细对接进一步研究天花粉与核心靶点的相互作用。根据Cytoscape软件预测的核心靶点在UniProt数据库下载相应的pdb文件，进行去除配体、去除水分子、加氢等常规处理后作为对接受体。以天花粉中主要成分为配体，用半柔性对接的方法进行分子对接。并用Pymol 2.5.0软件对结合能＜-8 kcal/mol的“分子-蛋白”结合进行可视化。

2 结果

2.1 天花粉成分鉴定结果 将天花粉分别在正负离子模式下进行检测。经unifi软件鉴定得到的化学成分共15种，主要包括氨基酸、四环三萜类、脂肪酸酯类、烯酮类、芳香醛类等化合物。见表1、图1。

图1 天花粉液质联用的总离子流图

表1 天花粉成分表

2.2 天花粉活性成分及靶点筛选结果 将天花粉15种化学成分经SwissADME筛选后得到Benzaldehyde、L-Citrulline、Dibutyl Phthalate、Cucurbitacin D、Geranylacetone、Methyl Pentadecanoate等6种潜在活性成分。将潜在活性成分导入SwissTarget Prediction网站预测得329个蛋白靶点。以“diabetes”为关键词检索GeneCards数据库并以Score值的8倍中位数筛选得到1,339个糖尿病高相关靶点。通过R软件运行ggvenn包分析得到93个天花粉防治糖尿病靶点，并可视化为Venn图，见图2。

图2 天花粉与糖尿病相关靶点Venn图

2.3 蛋白质互作（PPI）网络构建与分析 将药物和疾病交集靶点导入STRING网站进行蛋白质互作分析，获得61个高置信度蛋白靶点，经Cytoscape软件可视化为PPI网络图，见图3。根据PPI网络拓扑学分析筛选得到相关度较高的STAT3、AKT1、PIK3CA、MAPK14、AR、MAPK14、NR3C1、MAPK1、TNF、EGFR、PPARA等10个核心靶点。

图3 天花粉和糖尿病共同作用靶点PPI及核心靶点图

2.4 GO富集分析 GO功能富集通过天花粉61个高置信度靶点得到523个生物过程、77个分子功能、34个细胞组成等功能进程。其中多涉及细胞对化学应激反应（cellular response to chemical stress）等细胞应激反应、脂肪酸代谢过程（fatty acid metabolic process）等脂质代谢相关的生物过程部分以及氧化还原酶活性（oxidoreductase activity）为代表的氧化应激类分子的分子功能部分，并包含细胞膜上的膜筏（membrane raft）细胞膜组成类的细胞组成部分，见图4。

图4 GO富集分析二级分类柱状图

2.5 KEGG富集分析 将天花粉61个高置信度靶点进行KEGG 通路富集，得到显著相关（P＜0.01）的通路共126条，其中与糖尿病相关通路有38条，可视化得到KEGG富集分析气泡图，见图5。主要涉及Insulin resistance（胰岛素抵抗）、Endocrine resistance（内分泌抵抗）、TNF signaling pathway（肿瘤坏死因子信号通路）、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications（糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路）、Non-alcoholic fatty liver disease（非酒精性脂肪肝）、Apoptosis（细胞凋亡）、HIF-1 signaling pathway（缺氧诱导因子-1信号通路）、Pancreatic cancer（胰腺癌）、Insulin signaling pathway（胰岛素信号通路）、VEGF signaling pathway（VEGF信号通路）等糖尿病相关通路。

图5 KEGG富集分析气泡图

2.6 “药物-成分-靶点-通路-疾病”网络图构建 将筛选得到天花粉的活性成分、靶点及KEGG富集通路前10条通路导入Cytoscape构建“药物-成分-靶点-通路-疾病”网络图，见图6。

图6 “成分-靶点-通路”网络图

2.7 分子对接 分子对接结合能若≤-7.0 kcal/mol表明有较好的结合能力。通过分子对接发现Cucurbitacin D仅与TNF结合能＞-7.0 kcal/mol，与STAT3、AKT1、PIK3CA、MAPK14、AR、MAPK14、NR3C1、MAPK1、EGFR、PPARA等9个核心蛋白的结合度均较强。其中，Cucurbitacin D与PIK3CA的结合能高达-9.2 kcal/mol。此外，Geranylacetone与MAPK14的结合度也较高，拥有较好的结合能力。见图7。

图7 分子对接热图及高结合度“分子-蛋白”结合图（TOP 3）

3 讨论

糖尿病属于中医学“消渴病”范畴，《黄帝内经》有论及糖尿病具有内热消渴的特点［5］。天花粉，又名栝楼根，《神农本草经》中有对其作用的描述“主消渴，身热，烦满，大热，补虚安中，续绝伤”，可见天花粉治疗内热消渴的糖尿病由来已久。《伤寒杂病论》中也提及天花粉养阴止渴法治疗糖尿病的经方，如栝楼牡蛎散、栝楼瞿麦丸等［6］。

研究表明，天花粉和多数中药一样通过多种组分、多个靶点和多条通路发挥高效低毒的预防和治疗作用［7］。中药拥有整体性、系统性多点作用治疗带来优越性，但所涉及复杂的化学成分和多样的药理作用的问题，也为进一步研究其作用机制带来了巨大的难度［8-9］。网络药理学建立在高通量数据基础上，使用算法计算和统计分析结合网络数据库检索，生成“药物-成分-靶点-通路-疾病”相互作用关系网络图，进而阐述药物治疗疾病的具体途径，为传统中药研究提供新的思路［10］。液质联用则从整体的角度出发，系统解析天花粉的化学成分组成，为网络药理学药物靶点的预测提供更为精准的分析数据，为通路作用机制的探索打下坚实的基础。

本研究通过液质联用技术结合数据库快速解析得到天花粉存在以Benzaldehyde、L-Citrulline、Dibutyl Phthalate、Cucurbitacin D、Geranylacetone、Methyl Pentadecanoate等为代表的活性成分。其中Cucurbitacin D通过调节JAK/STAT3、PI3K/Akt/mTOR和MAPK信号传导途径诱导凋亡，这可能是其发挥作用的机制［11］。L-Citrulline通过胰岛素介导的细胞信号通路影响血压调节、降脂和葡萄糖稳态，在糖尿病和相关并发症的防治中发挥重要作用［12］。

PPI网络拓扑学分析得到STAT3、AKT1、PIK3CA、MAPK14、AR、MAPK14、NR3C1、MAPK1、TNF、EGFR、PPARA等可能为天花粉发挥作用的核心靶点。研究表明，STAT3是一种转录因子，可调节与细胞存活、增殖、激活和分化相关的基因的表达，并在胰岛发育和胰岛素分泌中发挥重要作用［13］。AKT1是PI3K/AKT/mTOR信号通路的重要组成部分，参与迁移、增殖、生长和存活的细胞过程，并在葡萄糖代谢中起到重要作用［14］。

GO富集分析发现，天花粉可能主要通过氧化还原酶等潜在分子功能以调节细胞的氧化应激生物学过程，作用于涉及细胞膜等细胞组分方面以及脂质代谢等生物学进程，从而发挥防治作用。为进一步探究天花粉防治糖尿病的分子机制，实现精准靶向用药和新药的开发，采用KEGG通路富集分析，结果发现高置信度的相关靶点主要集中在胰岛素抵抗、内分泌抵抗、胰岛素信号通路、胰腺癌等以胰岛素为核心的通路，这些通路被证实和糖尿病具有高相关性［15］。天花粉防治糖尿病亦与TNF信号通路、糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路、HIF-1信号通路等氧化应激通路和细胞凋亡通路相关。此外还与非酒精性脂肪肝、VEGF信号通路等关联性疾病通路存在一定的联系。较多研究表明，HIF-1通路与糖尿病有关，HIF-1α对于维持胰腺β细胞的功能和存活很重要，且T1DM患者中HIF-2β的mRNA表达降低［16］。通过分子对接研究发现，天花粉可能主要通过Cucurbitacin D作用STAT3、MAPK14、PIK3CA等关键靶点实现改善糖尿病的效果。后续可结合分子动力学模拟、人工智能等方法进一步探究其机制［17-18］。

通过液质联用联合网络药理学发现，天花粉可能通过Cucurbitacin D等活性成分调控以AGE-RAGE信号通路（在糖尿病并发症中）、胰岛素抵抗为代表的胰岛素相关通路，提升胰岛素的分泌和敏感性，从而作用于机体的细胞以调节血糖，预防糖尿病的发生或延缓糖尿病的发展，平衡机体血糖等重要组分以形成稳态，达到防治糖尿病的作用。