老年重症肺炎并发ARDS患者血清miR-27a、FOXO3与疾病严重程度及预后的关系

金娴,邵振华,何梅,姜俊,王志安,任蕾

老年人因宿主免疫受损、吞咽功能障碍和伴有多种基础疾病成为肺炎高发人群,且常因肺部炎性反应得不到有效控制进展为重症肺炎[1]。急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是老年重症肺炎最严重的并发症之一,也是导致老年重症肺炎患者死亡的重要因素[2]。因此及时评估老年重症肺炎并发ARDS患者病情严重程度及预后至关重要。炎性反应参与ARDS发生发展[3],研究表明,微小核糖核酸(microRNA,miRNA)通过调控炎性反应在ARDS过程中发挥重要作用[4]。miR-27a是一种炎性反应相关miRNA[5],有学者通过miRNA筛选发现[6],miR-27a为重症社区获得性肺炎并发ARDS患者血清差异表达miRNA之一。叉头框蛋白O3(forkhead box O3,FOXO3)是一种转录因子,参与细胞自噬、细胞凋亡、炎性反应、氧化应激等多种病理生理过程[7]。实验报道[8],FOXO3在急性肺损伤/ARDS小鼠肺组织中高表达。本研究拟探讨老年重症肺炎并发ARDS患者血清miR-27a、FOXO3与疾病严重程度及预后的关系,以期为改善老年重症肺炎并发ARDS患者预后提供更多参考依据,报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2022年10月—2023年9月上海市静安区中心医院重症医学科收治老年重症肺炎并发ARDS患者108例为ARDS组,男67例,女41例,年龄60～89(73.12±6.75)岁;老年重症肺炎未并发ARDS患者72例为非ARDS组,男44例,女28例,年龄60～88(74.17±6.90)岁;另选取医院同期老年体检健康志愿者60例为健康对照组,男36例,女24例;年龄60～89(73.03±7.14)岁。3组性别和年龄比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准[(2022)伦审第39号],受试者或家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准:①年龄≥60岁;②初次确诊为重症肺炎或重症肺炎并发ARDS;③重症肺炎符合《中国急诊重症肺炎临床实践专家共识》[9]诊断标准;④ARDS符合《急性呼吸窘迫综合征:柏林新定义》[10]诊断标准;⑤临床病历资料完整。(2)排除标准:①合并肺结核、慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)、先天性肺发育不良等其他肺疾病;②脑卒中、终末期肾病等重大疾病或疾病终末期;③恶性肿瘤患者;④自身免疫性疾病;⑤哺乳期、妊娠期妇女。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 资料收集:性别、年龄、肺炎类型(社区/医院获得性肺炎)、吸烟史、饮酒史、基础疾病、机械通气时间、白细胞计数、血肌酐、血尿素氮、C反应蛋白、降钙素原等资料。

1.3.2 血清miR-27a、FOXO3水平检测:患者于入院时和健康对照组体检时采集空腹肘静脉血4 ml,置于EDTA抗凝管中30 min,离心留取上层血清,保存于-80℃冰箱中待测。按照南京诺唯赞生物科技股份有限公司提供的RNA提取试剂盒(编号 RC112-01)说明书提取总RNA,按照南京赛泓瑞生物科技有限公司提供的逆转录试剂盒(编号 DV807A)说明书逆转录为cDNA。以cDNA为模板,miR-27a以U6为内参,FOXO3以GAPDH为内参,根据翌圣生物科技(上海)股份有限公司提供的实时荧光定量聚合酶链式反应试剂盒(编号 11203ES03)说明书进行扩增。反应体系:2×Master Mix 10 μl、上游引物0.5 μl、下游引物0.5 μl、cDNA 2.0 μl、加DEPC水至20 μl;反应条件:预变性 95℃ 30 s 1次,变性95℃ 5 s 40次,退火延伸60℃ 40 s 40次。65～95℃绘制溶解曲线,用2-ΔΔCT法表示血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平。引物由武汉金开瑞生物工程有限公司合成,miR-27a上游引物5＇-AAGGAGCCCCACGAGAAAAA-3＇,下游引物5＇-ACCGAACTTGCATTGATTCC-3＇;U6上游引物5＇-CTCGCTTCGGCAGCACA-3＇,下游引物5＇-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3＇;FOXO3上游引物5＇-ACACTCCAGCTGGGTCCCTGA-3＇,下游引物5＇-TGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3＇;GAPDH上游引物5＇-CTCGCTTCGGCAGCACATATA-3＇,下游引物5＇- ACGAATTTGCGTGTCATCCT-3＇。

1.3.3 miR-27a与FOXO3的结合位点预测:通过TargetScan数据库https://www.targetscan.org/vert_72/预测miR-27a与FOXO3的结合位点。

1.3.4 老年重症肺炎并发ARDS患者病情和预后分组:老年重症肺炎并发ARDS患者入院后,根据氧合指数(动脉血氧分压/吸入氧浓度)分为轻度亚组(200 mmHg<氧合指数≤300 mmHg,26例)、中度亚组(100 mmHg<氧合指数≤200 mmHg,34例)、重度亚组(氧合指数≤100 mmHg,48例)。并根据老年重症肺炎并发ARDS患者28 d预后情况分为死亡亚组33例和存活亚组75例。

2 结 果

2.1 3组血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平比较 健康对照组、非ARDS组、ARDS组血清miR-27a水平依次降低,FOXO3 mRNA水平依次升高(P均<0.01),见表1。

表1 3组血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平比较

2.2 血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平在不同病情程度老年重症肺炎并发ARDS患者中比较 轻度亚组、中度亚组、重度亚组血清miR-27a水平依次降低,FOXO3 mRNA水平依次升高(P均<0.01),见表2。

表2 血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平在不同病情程度老年重症肺炎并发ARDS患者中比较

2.3 血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平与氧合指数的相关性 经TargetScan数据库预测,miR-27a与FOXO3的3＇-非翻译区3257～3264处存在结合位点(图1)。Pearson相关性分析显示,血清miR-27a与FOXO3 mRNA水平呈负相关(r=-0.736,P<0.001);Spearman相关性分析显示,血清miR-27a水平与氧合指数呈正相关,FOXO3 mRNA水平与氧合指数呈负相关(rs=0.751、-0.785,P均<0.001)。

图1 miR-27a与FOXO3的结合位点图

2.4 不同预后老年重症肺炎并发ARDS患者临床资料比较 老年重症肺炎并发ARDS患者108例，28 d死亡33例(30.56%)。 死亡亚组患者年龄大于存活亚组,机械通气时间长于存活亚组,氧合指数、miR-27a低于存活亚组,C反应蛋白、FOXO3 mRNA高于存活亚组(P<0.05),2亚组其他资料比较差异无统计学意义(P>0.05),见表3。

表3 不同预后老年重症肺炎并发ARDS患者临床资料比较

2.5 多因素Logistic回归分析影响老年重症肺炎并发ARDS患者预后的因素 以老年重症肺炎并发ARDS患者预后(死亡/存活=1/0)为因变量,以表3中P<0.05项目(年龄、机械通气时间、氧合指数、C反应蛋白、miR-27a、FOXO3 mRNA)为自变量,建立影响老年重症肺炎并发ARDS患者预后的多因素Logistic回归模型。结果显示,年龄增加、机械通气时间延长、FOXO3 mRNA升高为影响老年重症肺炎并发ARDS患者预后的独立危险因素,氧合指数升高、miR-27a升高为独立保护因素(P<0.05),见表4。

表4 影响老年重症肺炎并发ARDS患者预后的多因素Logistic回归分析

2.6 血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平对老年重症肺炎并发ARDS患者死亡的预测价值 绘制血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平单独与联合预测老年重症肺炎并发ARDS患者死亡的ROC曲线,结果显示:血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平及二者联合预测老年重症肺炎并发ARDS患者死亡的曲线下面积(AUC)分别为0.784、0.786、0.879,二者联合的AUC大于血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平单独预测(Z=2.550、2.963,P=0.011、0.003),见表5、图2。

表5 血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平预测老年重症肺炎并发ARDS患者死亡的价值

3 讨 论

ARDS是一种由各种诱导因素引起的难以控制且危及生命的进行性呼吸窘迫和急性呼吸衰竭,其特点是严重肺部炎性反应、肺上皮和内皮细胞损伤、肺泡—毛细血管膜通透性增加、低氧血症和非心源性肺水肿等[11]。老年重症肺炎患者由于肺实质(细支气管、肺间质、肺泡等)炎性反应加重,诱发失控性炎性反应,加剧肺部损伤导致ARDS[12]。老年重症肺炎并发ARDS具有全身器官功能减退、基础疾病多、防御功能和呼吸免疫系统低下、顽固性低氧等特点,截止目前尚无特效治疗方法,治疗难度大,常因并发多器官衰竭而死亡[13]。

炎性反应被认为是ARDS发生发展的核心机制,炎性反应通过破坏肺上皮和内皮细胞,增加肺泡—毛细血管膜通透性,引起大量液体渗漏而促进ARDS发生发展[3]。miRNA是一种短链非编码RNA,能与靶基因特异性位点结合在转录后水平调控基因表达,从而参与ARDS进程[14]。miR-27a定位于人染色体19p13.12,既往研究多关注其在恶性肿瘤中的作用,近年研究发现miR-27a还参与肺炎性反应过程。王艳琼等[15]实验报道,miR-27a在肺炎链球菌诱导的人肺泡上皮细胞损伤模型中低表达,上调miR-27a能靶向抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕靶蛋白信号通路,下调白介素(interleukin,IL)-6等促炎细胞因子表达,以缓解肺炎链球菌所致的细胞损伤,提示miR-27a参与肺炎过程。实验报道,miR-27a过表达能靶向抑制Toll样受体4/核因子κB(Toll-like receptor 4/nuclear factor κB,TLR4/NF-κB)信号通路,改善肺结核大鼠肺部炎性反应损伤[16]。脂多糖建立的脓毒症小鼠模型中,抑制miR-27a能上调磷酸酯酶与张力蛋白同源物表达,抑制肺部促炎细胞因子表达,进而加重脓毒症诱导的肺损伤[17]。提示miR-27a还对多种原因所致肺损伤具有重要的保护作用。本研究结果显示,健康对照组、非ARDS组、ARDS组血清miR-27a水平依次降低,提示低血清miR-27a水平与老年重症肺炎并发ARDS有关。结果还显示,老年重症肺炎并发ARDS患者血清miR-27a水平随着病情加重而降低,miR-27a升高为影响老年重症肺炎并发ARDS患者预后的独立保护因素,这提示低血清miR-27a水平与老年重症肺炎并发ARDS患者疾病加重和预后不良有关。其机制可能是,miR-27a能靶向抑制TLR4/髓样分化因子88/NF-κB信号通路,减少促炎细胞因子和促血管通透性因子释放,抑制肺部炎性反应发展和肺微血管通透性增强,减少肺上皮、肺内皮细胞凋亡,从而改善老年重症肺炎并发ARDS患者病情和预后[18]。

FOXO3/FOXO3a是一种高度保守的转录因子,具有调节脂代谢、炎性反应、免疫反应、血管生成、DNA修复、细胞自噬、细胞凋亡、应激抵抗等多种作用[19]。Chen等[20]实验报道,FOXO3在肠缺血再灌注小鼠模型中表达上调,体外敲低FOXO3能抑制炎性因子表达,进而减轻肠缺血再灌注所致的肺损伤。Zhou等[21]实验报道,下调FOXO3能通过抑制NOD样受体热蛋白结构域蛋白3炎性小体活化,减轻炭黑纳米颗粒诱导的大鼠肺部炎性反应。抑制FOXO3表达能改善慢阻肺大鼠肺组织IL-1β、IL-2等炎性因子表达[22]。这些研究提示FOXO3在肺部炎性反应损伤中发挥重要作用。同时研究报道,下调FOXO3能减轻脓毒症诱导的急性肺损伤[23]。本研究结果显示,健康对照组、非ARDS组、ARDS组血清FOXO3 mRNA水平依次升高,提示高血清FOXO3 mRNA水平与老年重症肺炎并发ARDS有关。结果还显示,老年重症肺炎并发ARDS患者血清FOXO3 mRNA水平随着病情加重而升高,为影响老年重症肺炎并发ARDS患者预后的独立危险因素,这提示高血清FOXO3 mRNA水平与老年重症肺炎并发ARDS患者疾病加重和预后不良有关。其机制可能是,FOXO3能通过结合NF-κB RelA(p65)激活NF-κB信号通路,通过增加炎性细胞因子释放,加剧肺血管、肺上皮、肺内皮等组织损伤,导致老年重症肺炎并发ARDS患者病情加重和死亡风险增加[24]。同时FOXO3作为介导线粒体自噬调控的关键途径[25]。FOXO3升高还会增强Ⅱ型肺泡细胞自噬活性,导致肺泡细胞过度自噬,诱导肺泡细胞凋亡,进而加重老年重症肺炎并发ARDS患者病情和降低预后[26]。

本研究通过在线预测发现miR-27a与FOXO3存在结合位点,相关性分析证实在老年重症肺炎并发ARDS患者血清中二者水平呈负相关,这提示miR-27a与FOXO3可能共同参与老年重症肺炎并发ARDS发生发展。Shang等[27]通过双荧光素酶报告实验证实,miR-27a能靶向下调FOXO3,以减轻脂多糖诱导的肺泡上皮细胞炎性反应和凋亡。本研究结果还显示,年龄、机械通气时间和氧合指数为影响老年重症肺炎并发ARDS患者预后的独立因素,考虑原因如下:年龄越大的患者全身器官功能减退越严重,免疫力、防御力、抗应激能力更差,因此死亡风险更高;机械通气时间延长说明患者低氧血症更严重,因此死亡风险更高;氧合指数作为评估ARDS患者病情严重程度的指标,其指数越高提示患者病情越轻,因此死亡风险更低。最后本研究ROC曲线结果显示,血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平预测老年重症肺炎并发ARDS患者死亡的AUC为0.784、0.786,二者联合预测的AUC为0.879,较单独预测显著增加。这提示血清miR-27a、FOXO3 mRNA水平可能成为老年重症肺炎并发ARDS患者预后辅助预测指标,而同时检测能更好地判断患者预后。但还需实验验证miR-27a与FOXO3参与老年重症肺炎并发ARDS的机制,同时本结论也有待多中心研究进一步验证。

综上,血清miR-27a水平降低和FOXO3 mRNA水平升高与老年重症肺炎并发ARDS患者疾病加重和预后不良有关,miR-27a与FOXO3可能共同参与老年重症肺炎并发ARDS发生发展,二者联合对老年重症肺炎并发ARDS患者死亡具有较高的预测价值。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

金娴:设计研究方案,实施研究过程,论文撰写;邵振华、姜俊、王志安:实施研究过程,资料整理收集;何梅:提出研究思路,分析试验数据,进行统计学分析;任蕾:课题设计,论文修改,论文审核