转基因棉花耐除草剂鉴定及遗传稳定性分析

马克鹤，郑 凯，陈全家

（新疆农业大学农学院作物遗传改良与种质创新重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830000）

传统的作物生产中，使用除草剂进行田间杂草处理已成为现代农业不可缺少的一部分，除草剂虽能防除杂草，但也会对作物生长产生影响[1]。随着转基因抗虫棉培育成功，通过转基因技术将抗病、抗除草剂、品质优异的相关基因导入到棉花中的研究越来越多[2-3]，并大规模投入生产。

农杆菌介导法是目前应用最广泛的遗传转化方法，能够将完整的基因片段导入到受体中，且在后代中稳定遗传[4]。本试验前期通过将抗性标记基因、目的基因与表达载体重组构建，将重组载体转化至农杆菌中，经过扩大培养后，将菌液通过授粉的方式把外源基因导入至受体中，已有研究人员通过该方法经除草剂筛选以及PCR 分子鉴定获得了转基因植株[5-6]，但所用的除草剂为草甘膦，而草铵膦除草剂见效快，在除草速度、除草范围、除草效果及杂草再生期等田间表现方面均优于草甘膦。Bar基因可使植物抵抗以PPT 为活性的草铵膦除草剂，此类除草剂能够使植株叶绿体解体，导致叶片干枯，最终死亡。HCT 是一种木质素合成酶，在木质素单体的合成中起着上下游调节作用。调控HCT基因的表达量进而调节植物中木质素含量，由此可以证实HCT 可促进纤维发育。本试验将目的基因与抗除草剂基因一同导入到棉花受体的转基因后代通过草铵膦除草剂筛选及PCR 鉴定，能够快速筛选出目的基因成功整合的单株，研究转基因材料的遗传稳定性，分析GbHCT基因的导入对棉花的农艺性状产生的表型影响，初步探讨GbHCT基因在棉花发育中的作用，为后续该转基因材料的环境安全释放、筛选更为优异的品种提供了可靠的分子依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

转基因材料是前期采用农杆菌介导喷花法将目的基因GbHCT13、GbHCT15导入到陆地棉Y1169，转GbHCT13、GbHCT15基因棉花表达载体均由本课题组实验室构建，本试验所用的受体品种为Y1169，其目的基因GbHCT来自海岛棉新海21。本研究所用引物（见表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；PCR 反应试剂Taq DNA 聚合酶为MBI Fermentas公司产品；DNA Marker、dNTP Mix 为天根生化科技有限公司产品。

本试验前期利用BglⅡ与BstE Ⅱ对pCAMBIA3301载体双酶切，然后将带有pCAMBIA3301-GbHCT13/GbHCT15重组载体的农杆菌菌液通过农杆菌介导喷花法转化到棉花中，其中载体所含标记基因bar基因（草铵膦除草剂抗性基因）长为475 bp，GbHCT13基因长为1 311 bp，GbHCT15基因长为1 248 bp。

1.2 试验时间

大田试验于2021 年在新疆维吾尔自治区塔城地区沙湾市新疆农业大学棉花育种基地进行；室内试验于2022 年在新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市新疆农业大学农学院实验室进行。

1.3 试验方法

1.3.1 除草剂筛选

大田试验将草铵膦原液Basta 600、700、800µL，与表面活性黏附剂吐温20 1 600µL 和纯净水1 L 配制成3 个体积分数，分别对大田转基因棉花进行喷洒，3～9 d 后观察变色叶片及死亡植株，标记未变色植株，依据变色程度将叶片反应分为3 种类型（见图1），收集大田中转基因抗性植株并经PCR 鉴定为阳性的植株种子，记录编号，确定单株株系，在室内按株系种植。室内试验同样按照大田适用体积分数将除草剂涂抹于幼苗植株的叶片上，连续3 d 相同叶片，3 d后统计棉花叶片枯萎情况（见图2），拔除叶片干枯的植株。

图1 不同体积分数草铵膦除草剂喷洒3 d 后棉花叶片的反应

图2 室内涂抹体积分数为800µL/L 的草铵膦除草剂

1.3.2 PCR鉴定

1)取新鲜的棉花嫩叶，参照改良的DNA 提取技术提取转基因棉花的基因组，所提取的DNA 取1µL 放置核酸浓度检测仪上进行检测。

2)取适量DNA 样品稀释，稀释至200 ng/µL，PCR反应体系25µL，取上下游引物各1µL、ddH2O 10µL、DNA 样品1µL、Mix 混合液（含Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、10×Reaction buffer）12.5µL。

3)按照PCR 扩增程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，经过35 个循环后72 ℃终延伸10 min，将所获得的PCR 产物于4 ℃保存；随后进行1%琼脂糖凝胶电泳，照胶显影，观察目的条带。

1.3.3 转基因棉花农艺性状分析

对PCR 检测为阳性的T2代转基因棉花进行农艺性状调查，在棉花吐絮时期，每个转基因品系随机测取5 株的株高、果枝数、有效果枝数、铃数和有效铃数等农艺性状，用SPSS 软件对所测得的农艺性状进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 除草剂筛选转基因品系棉花

通过图1 可以看出，由于除草剂产生药害需3 d左右，当除草剂体积分数为600µL/L 时，3 d 后未转基因棉花叶片无明显变化，6 d 后植株叶片出现浅黄色斑点，9 d 后叶片干枯；当除草剂体积分数为700µL/L时，未转基因棉花叶片3 d 后有浅黄色斑点，6 d 后叶片干枯；当除草剂体积分数为800µL/L 时，3 d 后未转基因棉花叶片明显黄化，且茎尖生长点干枯，第6 天时整株棉花死亡。转基因植株叶片经3 个体积分数除草剂喷洒后叶片均无变化。为能够高效快速进行筛选，选择体积分数为800 µL/L 的除草剂作为筛选体积分数，喷洒后第3 天进行观察。

由图2 可以明显看出，在幼苗期对每株植株的同一叶片涂抹大田适用的草铵膦除草剂，编号为1 的植株涂抹除草剂后叶片未有任何反应，初步鉴定为阳性，而编号为2、3、4 的植株涂抹除草剂后出现了变化，未转基因植株叶片不仅明显黄化且生长受到抑制。

2.2 转基因棉花农艺性状分析

对农艺性状进行分析（见表2），得出转GbHCT13品系的株高与对照Y1169 相比显著增加，而转GbHCT15品系的株高与对照Y1169 相比略有增加；转GbHCT15品系的果枝数与对照Y1169 相比显著增加，在有效果枝数方面，转GbHCT15品系相比对照Y1169也显著增加，而转GbHCT13品系在果枝数与有效果枝数方面比对照组略有升高；铃数方面，转GbHCT15品系的挂铃数更多，与对照差异达到极显著水平；转GbHCT13品系和转GbHCT15品系的有效铃数与对照相比显著增加。由以上结果得出，目的基因导入到受体后，其各性状都发生了显著变化，各项农艺性状均有提高。综上，转GbHCT15品系和其他转基因材料在与对照相比时，在果枝数、有效果枝数、铃数和有效铃数方面差异显著。

表2 转基因品系农艺性状与对照之间的比较

3 讨论与结论

在2 片真叶期喷洒大田体积分数适宜的除草剂，非抗性材料真叶受伤无法进行光合作用，生长点受到抑制最终芽尖枯死，而转基因抗除草剂材料叶虽会表现出水浸状，但子叶与生长点未受影响。在幼苗期利用适宜体积分数的除草剂既可去除田间杂草，也不影响棉花正常生长，还能在田间大规模筛选出转基因抗性植株。此筛选方法虽然简单，但容易出现假阳性及误筛，可作为转基因植株的初步筛选，获得更为准确的结果还需进行分子水平的鉴定。

根据草铵膦除草剂抗性基因bar同时也可作为标记基因对两代转基因抗性植株进行PCR 鉴定，试验结果表明，T3代转基因抗性植株有部分存在目的基因的缺失，研究表明，推测在子代遗传的减数分裂过程中，外源Bar基因与目的基因插入早期没有在染色体中稳定，从而呈现不规律分离，但随着代数的增加，转化的目的基因大多能够稳定遗传给子代。因此，如何稳定地将外源基因遗传给下一代，仍是当前转基因技术的难题之一。本次试验中，T2代阳性植株的农艺性状表明，外源基因的插入使农艺性状发生了明显改变，其中转GbHCT15品系的棉花在果枝数、铃数等方面与对照相比显著增加，以往研究中，HCT基因在茎秆的纤维发育中具有重要作用，能够促进纤维细胞的生长与分化。因此本试验推测HCT基因的导入促使棉花植株生长发育，使转基因品系株高均高于对照组，同时2 个转基因品系的结铃数均明显高于对照组，HCT基因的导入具有提高棉花产量的潜力。