基于FAP基因启动子的心肌纤维化药物筛选系统的建立与验证

周驰，阚洪爽，杨雅元，孟祥雯，欧阳昌汉，杨晓松

（湖北科技学院糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室，湖北咸宁 437100）

心肌纤维化会导致心脏形态结构重塑，舒张功能障碍，是心衰的重要诱因。心肌成纤维细胞分化为肌成纤维细胞是心肌纤维化的主要病理特征之一，该过程诱导细胞外基质，如Ⅰ型胶原蛋白（ColⅠ）和Col Ⅲ持续性分泌，显著改变心肌的力学微环境（基质硬度增加），进一步促进心肌成纤维细胞分化［1-2］。

成纤维细胞激活蛋白（fibroblast activation protein，FAP）是一种膜整合性脯氨酸特异性丝氨酸蛋白酶，常在伤口修复、心肌纤维化和肿瘤纤维化中高表达，参与组织重塑、炎症、纤维化、肿瘤增殖和骨质疏松症等重要病理生理调控过程［3］。但FAP 在人或小鼠的正常成纤维细胞、正常或恶性上皮细胞以及良性上皮肿瘤间质中却低表达，甚至检测不到［4-5］。最新研究表明,FAP 促进脑钠肽（brain natriuretic peptide,BNP）降解是其促进心肌损伤的重要原因［3］。目前，已有多项研究探讨FAP作为肿瘤纤维化和心肌纤维化诊断的重要生物标志物，甚至作为免疫治疗的重要靶点［5-7］。

心肌纤维化发生发展过程复杂，目前的临床药物仅能延缓心肌纤维化进程，治疗效果非常有限，而联合用药治疗往往会带来一定的不良反应。因此，进一步开发新的心肌纤维化防治药物尤为重要。而在药物开发过程中，一种简单、高通量和重复性好的药物筛选方法是关键。双荧光素酶报告基因检测系统是目前分析基因转录调控的有效手段，具有简便、灵敏和重复性好等优点［8］。

本研究通过体外合成启动子FAP基因片段，并克隆至双荧光素酶报告质粒psiCHECK2 上以替换HSV-TK 启动子而获得新的双荧光素酶报告质粒psiCHECK2-FAP，建立psiCHECK2-FAP 双荧光素报告系统来分析抗心衰药物达格列净（dagaliazine，Dapa）的干预对转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）和棕榈酸（palmitic acid，PA）诱导的心肌成纤维细胞中荧光素酶活性的变化，进一步验证该系统的有效性，为心肌纤维化防治药物的研发提供策略。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂和主要仪器

小鼠心肌成纤维细胞（mouse cardiac fibroblast，MCF）（批号：BNCC340098），商城北纳创联生物科技有限公司。质粒psiCHECK2，金开瑞生物科技有限公司；限制性内切核酸酶Hind Ⅲ（批号：1060S）、NotⅠ（批号：1166S）、ApaⅠ（批号：1005S）和T4 DNA连接酶（批号：2011A），北京宝日医生物技术有限公司；Dapa（批号：BMS-512148），美国MCE 公司；RPMI 1640 培养基（批号：MA0555）、EDTA 胰酶消化液（批号：MA0233）、优级胎牛血清（批号：PWL001）、PA（批号：MB7088）、RIPA 裂解液（批号：MA0151）、苯甲基磺酰氟（批号：MA0001）、蛋白酶抑制剂混合物（批号：MB2678）和飞克特超敏ECL 发光液（批号：MA0186），大连美仑生物技术有限公司；青霉素-链霉素溶液（批号：C0222），上海碧云天生物技术有限公司；去内毒素质粒小提试剂盒（批号：D6915），美国Omega Biotek 生物科技有限公司；质粒转染试剂（批号：SL100499），SignaGen 生物科技有限公司；TGF-β1（批号：P01137），深圳欣博盛生物科技有限公司；Ang Ⅱ（批号：D11178），北京沃凯生物科技有限公司；BCA 蛋白定量试剂盒（批号：KR0008）和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 抗体（批号：KR-0368R-HRP），武汉科瑞生物技术有限公司；8%PAGE 凝胶快速制备试剂盒（批号：20324ES62），上海翌圣生物科技股份有限公司；脱脂奶粉（批号：RM00014）、ColⅠ（批号：A5786）、ColⅢ（批号：A3795）和微管蛋白（tubulin）（批号：AC007），武汉爱博泰克生物科技有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（批号：DL101），南京诺唯赞生物科技股份有限公司。多功能Synergy2 酶标仪，美国BioTek公司；NanoDrop2000分光光度计，美国赛默飞世尔公司；ChemiDoc XRS+化学发光成像系统，美国Bio-Rad公司。

1.2 psiCHECK2-FAP重组质粒的构建

用限制性内切核酸酶NotⅠ与ApaⅠ双酶切psiCHECK2 质粒获得线性化载体；PCR 合成FAP基因启动子片段（在其5’端补齐载体上被切掉的hRluc基因的poly（A）尾序列，总长约573 bp）；T4 DNA 连接酶连接片段与线性化的载体形成重组质粒psiCHECK2-FAP，大肠杆菌DH5α 转化，筛选阳性菌落，抽提质粒。用HindⅢ消化重组质粒并通过琼脂糖凝胶电泳检测目标条带是否符合预期，同时将质粒送至武汉生工生物工程有限公司测序。

1.3 细胞培养、转染和分组

将MCF 细胞接种于6 孔培养板，每组设3 复孔。待细胞融合度为70%时，将psiCHECK2-FAP瞬时转染细胞，培养24 h 后更换新的完全培养基，分别给予TGF-β1（5 μg·L-1），Ang Ⅱ（1 μmol·L-1）或PA（100 μmol·L-1）处理0，12，24 和48 h，收集细胞检测荧光素酶活性；或者质粒转染细胞24 h 后，先用Dapa（1 μmol·L-1）预处理1 h，再分别给予TGF-β1（5 μg·L-1），Ang Ⅱ（1 μmol·L-1）或PA（100 μmol·L-1）处理24 h，检测荧光素酶活性与ColⅠ和Col Ⅲ蛋白表达。

1.4 Western 印迹法检测MCF 细胞中ColⅠ和ColⅢ蛋白表达

取1.3 制备的细胞，PBS 洗涤，加入RIPA 裂解液（含1% PMSF 与蛋白酶抑制剂），冰上静置5 min，于4 ℃，12 000×g离心15 min 收集上清液，BCA 法定量蛋白。将30 μg 蛋白样品经8% SDSPAGE 电泳，湿转至PVDF 膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h，一抗（ColⅠ和Col Ⅲ均1∶1000）4 ℃摇床孵育过夜；1×TBST 洗膜3 次，加入HRP 标记的二抗（1∶10 000）中37 ℃摇床孵育孵育1 h；1×TBST 洗膜3 次，经ECL底物显影，采用Bio-Rad凝胶成像系统采集图像，Image J软件进行半定量分析。用目的蛋白条带和内参蛋白条带积分吸光度（integrated absorbance，IA）比值表示目的蛋白相对表达水平。

1.5 双荧光素酶报告基因实验检测荧光素酶活性

按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明步书进行检测。取1.3 制备的细胞，用PBS 缓冲液洗涤细胞后，每孔加入1×细胞裂解缓冲液500 μL，置于脱色摇床上裂解10 min 使细胞完全裂解，收集细胞裂解液离心（12 000×g, 30 s）收集上清液。将细胞上清液以每孔20 μL加入黑色酶标板中，每组设3复孔；随后加入荧光素酶底物工作液100 μL置于酶标仪中立即读取萤火虫荧光素酶活性值；再加入海肾荧光素酶底物工作液100 μL，立即读取海肾荧光素酶活性。相对荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值。

1.6 统计学分析

实验结果数据用±s表示，用GraphPad Prism 8.0软件进行统计分析。多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 重组质粒psiCHECK2-FAP的构建和鉴定

图1所示，HindⅢ将重组质粒psiCHECK2-FAP切成2 个片段4200 和1760 bp，条带大小符合预期；质粒测序结果与理论序列完全一致。

Fig.1 Construction and identification of recombinant plasmid psiCHECK2-FAP. A：construction flowchart of recombinant plasmid psiCHECK-FAP；B：identification of plasmid psiCHECK-FAP digested by Hind Ⅲ. FAP：fibroblast activation protein；Lane 1：the product of digestion of plasmid psiCHECK2-FAP by Hind Ⅲ；Lane 2：plasmid psiCHECK2-FAP；M：DNA maker.

2.2 Dapa 干预对TGF-β1，Ang Ⅱ和PA 分别诱导MCF细胞中ColⅠ和Col Ⅲ蛋白水平影响

图2所示，与空白对照组相比，TGF-β1，AngⅡ和PA均能显著提高ColⅠ和Col Ⅲ蛋白表达（P＜0.05，P＜0.01）；分别与TGF-β1，Ang Ⅱ和PA 组相比，Dapa 干预后能够显著降低ColⅠ和Col Ⅲ蛋白表达（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.2 Effect of dagaliazine（Dapa）on protein expression levels of CollagenⅠ（Col Ⅰ）and CollagenⅢ（Col Ⅲ）in mouse cardiac fibroblast（MCF）cells induced by transforming growth factor-β1（TGF-β1）(A) or angiotensin Ⅱ（Ang Ⅱ）（B）or palmitic acid（PA）（C）by western blotting. MCF cells were pretreated with Dapa（1 μmol·L-1）for 1 h，and continually treated with TGF-β1（5 μg·L-1）or Ang Ⅱ（1 μmol·L-1）or PA（100 μmol·L-1）for 24 h. A2, B2 and C2 were the semi-quantitative result of A1,B1 and C1.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group；##P＜0.01，compared with TGF-β1，Ang Ⅱor PA group.

2.3 TGF-β1，Ang Ⅱ和PA 对MCF 细胞中FAP 启动子活性的影响

图3所示，相比于0 h，TGF-β1，AngⅡ和PA 分别处理12，24和48 h均显著提高荧光素酶活性（P＜0.05），24 h 达峰值；24 h 后荧光素酶活性略有下降，但与0 h相比仍显著增加（P＜0.05）。

Fig.3 Effect of TGF-β1（A）or Ang Ⅱ（B）or PA（C）on activity of FAP gene promoter in MCF cells evaluated based on luciferase activity. MCF cells were treated with TGF-β1（5 μg·L-1），Ang Ⅱ（1 μmol·L-1）or PA（100 μmol·L-1）for 0，12，24 and 48 h. Then, the cells were lysed by cell lysis buffer for 10 min, the supernatants of lysates were measured for firefly luciferases activity（F-luc）and renilla luciferases activity（R-luc）according to the instructions of Dual Luciferase Reporter Assay Kit.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with 0 h group.

2.4 Dapa 干预对TGF-β1，AngⅡ和PA 分别诱导MCF细胞中FAP启动子活性的影响

图4所示，与空白对照组相比，Dapa组荧光素酶活性无明显变化，TGF-β1，Ang Ⅱ和PA 组荧光素酶活性则明显升高（P＜0.05，P＜0.01）；分别与TGF-β1，AngⅡ或PA 组相比，Dapa 干预后荧光素酶活性明显下降（P＜0.05）。

Fig.4 Effect of Dapa intervention on FAP promoter activity induced by TGF-β1（A），Ang Ⅱ（B）or PA（C）in MCF cells evaluated based on luciferase activity. See Fig.2 for the cells treatment and see Fig.3 for the analysis of luciferases activity.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group；#P＜0.05，compared with TGF-β1，Ang Ⅱor PA group.

3 讨论

本研究以FAP基因启动子为响应靶点，联合双荧光素酶报告基因检测系统，建立了简单有效的心肌纤维化药物筛选系统。心肌成纤维细胞在维持心脏正常结构及功能中发挥重要作用，因其在心肌纤维化过程中大量合成和分泌纤维化所需基质成分而起重要作用，其中，ColⅠ和Col Ⅲ合成的增加是心肌纤维化的典型特征。既往研究报道，TGF-β1/Smad 和肾素/血管紧张素/醛固酮系统等信号通路的激活与心肌纤维化密切相关，TGF-β1与Ang Ⅱ分别是2 者发挥效应的关键分子［9］。游离脂肪酸是高血脂引发心血管疾病的重要物质基础，是心肌纤维化的重要危险因素［10］。Dapa 是一种钠-葡萄糖协同转运蛋白2 受体抑制剂，因其能够通过降低葡萄糖的重吸收，增加肾排泄而控制血糖，在临床上用于糖尿病的治疗。然而，临床研究发现，Dapa 对糖尿病、心肌肥厚和高血脂引起的心肌纤维化均有改善作用［11-13］，表明Dapa 具有抗心肌纤维化的作用。本研究表明，用促心肌纤维化细胞因子TGF-β1，AngⅡ和PA 分别刺激MCF 细胞，均能显著促进细胞中ColⅠ和Col Ⅲ的表达，而Dapa 的干预能够显著抑制促心肌纤维化因子诱导ColⅠ和Col Ⅲ的合成。以上结果表明，体外诱导心肌纤维化细胞模型建立成功。

肌成纤维细胞活化标志物FAP 是纤维化病理特征的重要标志物。已有研究报道，FAP 表达可作为心脏正电子发射断层显像检测［14］，心脏磁共振显像检测的重要标志物［15］。近期也有研究报道，将FAP 作为心肌纤维化治疗的靶点，表现出非常好的治疗潜能［16-17］。本研究将FAP基因启动子作为响应靶点，联合双荧光素酶报告基因检测系统而建立的心肌纤维化药物筛选系统，在促纤维化因子的刺激下，FAP基因启动子控制下的荧光素酶活性随着时间的增加而增强，24 h 达峰值，随后荧光素酶活性略有下降；当采用Dapa 干预后，促纤维化因子诱导的FAP基因启动子控制下的荧光素酶活性显著下降。该结果进一步提示，该药物筛选系统灵敏且有效。

综上所述，本研究构建了以FAP基因启动子作为响应靶点，联合双荧光素酶检测系统的心肌纤维化药物筛选系统，通过促纤维化因子的诱导和抗纤维化药物Dapa 的干预，进一步确证了该系统在促纤维化应答过程中的灵敏性和有效性，为心肌纤维化药物的研发提供了快速且高效的筛选策略。