eEF1A1调控水疱性口炎病毒和单纯疱疹病毒复制的初步研究

陈美桦，徐含翠，王林旭，罗洪，齐琦，王勃，段小涛

（1.南京中医药大学，江苏南京 210023；2.军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所，国家安全特需药品全国重点实验室，北京 100850）

水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）是弹状病毒科水疱病毒属，是一种负链RNA病毒。VSV 具有广泛的宿主范围，能够感染猪、马和人类等各类哺乳动物，其症状表现为舌、唇和乳头等部位出现水疱和溃烂，头疼和发热等症状［1-3］。由于VSV 结构简单，且复制快，已被广泛用于研究RNA病毒转录和复制［4］。

单纯疱疹病毒Ⅰ型（herpes simplex virus 1，HSV-1）属于疱疹病毒亚科，是一种DNA 病毒［5］。人类是HSV-1 天然宿主，病毒经呼吸道、口腔、生殖器粘膜以及破损皮肤等途径侵入机体，引起口唇疱疹、角膜炎、脑炎和生殖器感染等疾病［6］。有研究报道，HSV-1可增加人类免疫缺陷病毒感染的风险［7］，其复制快，致病性高，可使宿主终身感染［8］。

真核翻译延伸因子1A1（eukaryotic translation elongation factor1A，eEF1A1）属于GTP 结合蛋白，在mRNA 翻译时促进多肽链延伸［9］。eEF1A1具有多种功能，包括蛋白质翻译［10］、细胞生长［11-12］、肿瘤增殖［13］和病毒复制等［14-16］。eEF1A1参与多种蛋白的合成和翻译，而大多数病毒的复制都需要宿主蛋白的参与，因此提示eEF1A1 是病毒复制的一个重要因素。但目前关于eEF1A1影响病毒复制的研究大多都停留在eEF1A1 与RNA 病毒相互作用，如eEF1A1 可以与人类免疫缺陷病毒Ⅰ型的逆转录酶或乙型肝炎病毒X 蛋白相互作用［15-16］；eEF1A1 对不同种类病毒基因组复制的影响尚未明确报道。

因此，本研究用VSV 与HSV-1 分别建立RNA与DNA 病毒感染体系，探究eEF1A1 对不同种类病毒复制的影响，以确定一个广谱抗病毒新靶点；用双链RNA 类似物聚胞苷酸〔polyinosinic-polycytidylic acid，poly（I：C）〕或脱氧核糖核酸钠盐（herringtestis DNA，HT-DNA）去探究eEF1A1 是否参与天然免疫，尝试从宿主角度出发探究eEF1A1 对病毒复制的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞、病毒、试剂和仪器

人皮肤成纤维细胞株BJ-5ta 购自美国模式培养物集存库。VSV和HSV-1由本实验室于-80 ℃保存。poly（I：C）与HT-DNA，美国Sigma公司。

DMEM 培养基，德国Sigma 公司；胎牛血清、胰酶和磷酸盐缓冲液，北京中科迈晨；LipofectamineiMAX转染试剂，美国Invitrogen公司；苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，美国Selleck公司；Bradford蛋白定量试剂盒和ECL显影液，美国Thermo公司；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的山羊抗鼠IgG 抗体（批号：AS003）和HRP 标记山羊抗兔IgG 抗体（批号：AS014），武汉爱博泰克生物科技有限公司；eEF1A1抗体（批号：sc21758），美国SantaCruz；VSV 糖蛋白（VSV-G）抗体（批号：Ab50549）、HSV 糖蛋白B（HSV-gB）抗体（批号：Ab6506）、干扰素调节因子3（Interferon regulatory factor 3，IRF3）抗体（批号：Ab68481）和p-IRF3 抗体（批号：Ab76393），英国Abcam 公司；TANK 结合激酶1（TANK binding kinase 1,TBK1）抗体（批号：3504S）和p-TBK1 抗体（批号：5483S），美国CST公司；PVDF 转印膜，美国Millipore 公司；RNA 提取试剂盒（批号：DP419），天根生化科技（北京）有限公司；逆转录试剂盒（批号：RR035A-1），日本TaKaRa 公司。siRNA 核酸序列，广州锐博生物科技有限公司。

CFX96 实时荧光定量PCR 仪，美国Bio Rad 公司；Synergy H1 多功能酶标仪，美国Bio Tek 公司；JY300HE电泳仪，北京君意东方电泳设备有限公司；2720 梯度PCR 仪、1384 生物安全柜、Heracell VIOS 160i CO2 细胞培养箱、NanoDrop One 分光光度计，美国Thermo 公司；TS2-FL 倒置荧光显微镜，德国Nikon 公司；KLCZ-1220A 超净工作台，北京亚泰科隆仪器技术有限公司。

1.2 细胞传代和培养

将BJ-5ta 细胞用DMEM 完全培养基（含10%胎牛血清和1%青/链霉素）培养于37 ℃，5%CO2饱和湿度培养箱中。细胞密度至80%，按1∶3传代。

1.3 小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）的转染

将对数生长期BJ-5ta细胞以7×107L-1接种于24孔板，待细胞融合率达35%，转染siRNA。siRNA 核酸序列见表1。A 液：Lipofectamine-iMAX 1 μL 与opti-MEM 25 μL 混合，静置5 min；B 液：siRNA（20 μmol·L-1）0.6 μL 与opti-MEM 25 μL 混合，静置5 min；将A 液和B 液轻轻混匀，室温静置15 min。均匀滴加至每孔培养基中，培养6 h 后更换新完全培养基，继续培养48 h后，进行后续实验。

Tab.1 Sequences of small interfering RNA(siRNA)

1.4 病毒感染

将VSV 或HSV-1 病毒以感染复数（multiplicity of infection，MOI）为0.1 或1.0，加入至1.3 制备的细胞，培养2 h 后，更换新的含2%血清的培养基，放置37 ℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养。VSV 和HSV-1病毒均在Ⅱ级生物安全柜中使用。

1.5 核酸类似物poly（l∶C）或HT-DNA转染

取1.3 制备的细胞，然后转染poly（I:C）或HT-DNA。转染前1 h 更换DMEM 完全培养基，A液：Lipofectamine-iMAX 1 μL与opti-MEM 25 μL混合，静置5 min；B 液：poly（I:C）或HT-DNA（1 mg·mL-1）0.25 μL分别和opti-MEM 25 μL混合，静置5 min；将A 液和B 液轻轻混匀，室温静置15 min。均匀滴加至每孔培养基中，继续培养3 h和6 h 后收集细胞样品，提取RNA和蛋白检测相关分子的表达。

1.6 实时荧光定量PCR

按照RNA 提取试剂说明书提取细胞总RNA，将其逆转录为cDNA（反应条件：37 ℃15 min，85 ℃10 s），以cDNA为模板进行PCR扩增（反应条件：95 ℃10 min，95 ℃10 s，60 ℃30 s，共45个循环），数值均以GAPDH 为内参进行标准化，用2-ΔΔCt法计算目标基因mRNA 的相对表达水平，每组设置3复孔；相关引物序列见表2。

Tab.2 Primer sequence for RT-qPCR

1.7 Western印迹法

PBS 洗细胞，加入RIPA 裂解液（含蛋白酶和磷酸酶抑制剂）冰上静置5 min，BCA 法定量蛋白，取15 μg 蛋白样品经SDS-PAGE 电泳分离蛋白，蛋白湿转至PVDF 膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h，一抗〔抗VSV-G，HSV-gB，p-IRF3，p-TBK1，IRF3 和TBK1（均1∶2500），GAPDH（1∶10 000）〕4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜3 次，加入HRP 标记的山羊抗鼠或山羊抗兔lgG 抗体（1:5000）室温孵育1 h，TBST 洗膜3次，增强化学发光法（ECL）显影，暗室中曝光胶片。通过Image J软件对蛋白条带的积分吸光度进行分析，以目的蛋白与内参蛋白积分吸光度值的比值表示目标蛋白表达水平。

1.8 统计学分析

实验结果数据用±s表示，用Graphpad prism 8.3.0 软件进行统计分析。多组间采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 敲低eEF1A1效果验证

图1 显示，与阴性对照组相比，eEF1A1基因沉默组eEF1A1 的mRNA 和蛋白水平显著降低（P＜0.01），表明eEF1A1基因沉默的细胞模型构建成功。

Fig.1 Efficiency verification of knocking down of eEF1A1. BJ-5ta cells were transfected with siRNA for 48 h. A：the mRNA level of eEF1A1 was detected by RT-qPCR. B：the protein level of eEF1A1 was detected by Western blotting. C was the semi-quantitative result of B.IA:integrated absorbance.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with si-control group.

2.2 敲低eEF1A1抑制VSV复制

图2 显示，与阴性对照组相比，eEF1A1基因沉默组的VSV 基因拷贝数下降70%～80%（P＜0.01）；VSV蛋白表达显著降低（P＜0.01）。

Fig.2 Knockdown of eEF1A1 inhibits vesicular stomatitis virus(VSV)replication.BJ-5ta cells were transfected with siRNA for 48 h and then stimulated with VSV for 12 h. A：the genome copy number of VSV was detected by RT-qPCR.B：the protein level of VSV was detected by Western blotting. C was the semi-quantitativeresultof B. x±s，n=3.＊＊P＜0.01，comparedwith si-control group.

2.3 敲低eEF1A1抑制HSV-1复制

图3显示，与阴性对照组相比，eEF1A1基因沉默组HSV-1 的mRNA 水平下降50%～60%（P＜0.01）；HSV-1蛋白水平显著降低（P＜0.01）。

Fig.3 Knockdown of eEF1A1 inhibits herpes simplex virus 1 (HSV-1)replication. BJ-5ta cells were transfected with siRNA for 48 h and then stimulated with HSV-1 for 12 h. A：the mRNA level of HSV-1 was detected by RT-qPCR. B：the protein level of HSV-1 was detected by Western blotting.C was the semi-quantitative result of B. x±s，n=3. ＊P＜0.05,＊＊P＜0.01，compared with si-control group.

2.4 敲低eEF1A1 不影响poly（l：C）及HT-DNA 激活的胞内核酸识别免疫通路

图4 和5 显示，poly（I：C）或HT-DNA 诱导后，与阴性对照组相比，eEF1A1基因沉默组的IFN-β、ISG56和CXCL10的mRNA水平以及IRF3与TBK1的蛋白磷酸化水平无显著差异。

Fig.4 Knockdown of eEF1A1 does not affect the innate immune response to polyinosinic-polycytidylic acid[poly(l∶C) ]. BJ-5ta cells were stimulated with poly（I：C）after transfected with siRNA for 48 h.A:the mRNA levels of IFN-β,CXCL10 and ISG56 were detected by RT-qPCR. B1：the protein levels of p-IRF3 and p-TBK1 were detected by Western blotting. B2 was the semiquantitative result of B1.

Fig.5 Knockdown of eEF1A1 does not affect the innate immune response to herringtestis DNA (HT-DNA). BJ-5ta cells were stimulated with HT-DNA after transfected with siRNA for 48 h. A: the mRNA levels of IFN-β,CXCL10 and ISG56 were detected by RT-qPCR.B1：the protein levels of p-IRF3 and p-TBK1 were detected by Western blotting.B2 was the semi-quantitative result of B1.

3 讨论

病毒基因组mRNA 和蛋白是评价病毒复制量的关键因素。研究报道，eEF1A1 参与RNA 病毒转录酶复合体的形成［17］，但未涉及eEF1A1 对不同种类病毒基因组复制的影响。VSV 和HSV-1 常被当作工具病毒运用于先天免疫信号通路的研究中［18］。本研究表明，抑制eEF1A1 后，VSV 的基因拷贝数和蛋白水平显著降低；HSV-1的mRNA 和蛋白水平显著降低。以上结果提示，eEF1A1 对RNA 病毒和DNA病毒具有潜在的广谱调控作用。

病毒感染的先天免疫反应是由模式识别受体识别病毒核酸而引发的，其中包括Toll 样受体，RIG-I样受体和胞质DNA传感器。天然免疫是宿主抵抗病原入侵的第一道防线。感染病毒后，机体通过模式识别受体识别病毒的DNA 或RNA，快速启动固有免疫反应，有效清除入侵的病毒并进行机体损伤修复。在感知危险信号后，调控细胞抗病毒免疫的关键激酶TBK1 被激活，并进一步磷酸化转录因子IRF3，使其入核，诱导下游干扰素的产生［19］。TBK1 是固有免疫细胞抗病毒信号通路的中心节点，其活性和稳定性均需受到精细的控制，功能异常将导致自身免疫疾病和慢性炎症等疾病发生。本研究表明，干扰素激动剂双链RNA 类似物Poly（I：C）或HT-DNA刺激eEF1A1基因沉默的细胞后，IFN-β、CXCL10和ISG56的mRNA 水平以及TBK1与IRF3 的蛋白磷酸化水平均无显著差异。因此推测，eEF1A1 在体内对病毒复制量的影响可能不通过胞内核酸识别的天然免疫，但不排除eEF1A1 会通过其他天然免疫机制抑制病毒。同时有研究报道，eEF1A1 可与病毒相互作用［15-16］，推测其可能是直接靶向病毒。因此，关于eEF1A1 对病毒的具体作用机制还需进一步探究。

综上所述，本研究首次提出eEF1A1 影响DNA病毒复制，也可影响RNA 病毒复制，为新型广谱抗病毒药物的研发提供了新思路。基于抑制eEF1A1 对Poly（I：C）或HT-DNA 刺激的天然免疫分子无影响，提示eEF1A1 可能不参与胞内核酸识别的天然免疫，可能会通过其他机制帮助病毒进行免疫逃逸，为宿主免疫和病毒逃逸的研究提供基础。