基于网络药理学和分子对接技术探讨雷公藤治疗关节病型银屑病的作用机制

顾东彦，王子雯，许孟月，杨彤，陈姣，刘学伟

（河南中医药大学第一临床医学院，河南 郑州 450046）

关节病型银屑病（Psoriasis arthropathica）或称银屑病关节炎（Psoriatic arthritis，PsA）是银屑病的一种特殊类型，主要临床表现为在寻常型银屑病的皮损上伴有外周、中轴关节不同程度受累，严重影响患者的生活质量与身心健康[1]。有研究显示，PsA 在我国的发生率为5.8%[2]，国外报告PsA 在银屑病中约占6%～41%[3]。现代医学主要采用非甾体抗炎药、激素和生物制剂进行治疗，但存在治愈率低、不良反应大的风险[1]。中医认为湿热毒邪痹阻经络是本病的主要病因，而以雷公藤为主的中药提取物能有效改善类风湿性关节炎与银屑病的临床症状，缓解患者疼痛，提高生活质量，相关作用机制有待进一步探索[4]。

网络药理学基于系统生物学、多项药理学和蛋白组学，对生物系统进行网络分析，强调信号通路的多途径调节，提高药物的治疗效果，阐释药物的药理作用和疾病的发病机制[5]。本研究采用网络药理学方法分析中药雷公藤治疗PsA 的作用机制，为进一步的临床运用和实验研究提供客观科学依据。

1 资料与方法

1.1 雷公藤活性成分与潜在靶点收集 采用中药系统药理学分析平台（TCMSP）数据库（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），以“雷公藤”为检索词，以化合物口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18，筛选符合条件的活性成分及对应蛋白靶点，并使用Uniprot 数据库进行标准化。

1.2 PsA 疾病靶点收集 通过GeneCards（https：//www.genecards.org）、OMIM（http：//www.omim.org）、DrugBank（http：//go.drugbank.com）数据库，以“psoriasis arthropathica”、“psoriatic arthritis”为关键词进行检索，取交集并删除重复靶点，获取疾病靶点。

1.3 药物-靶点网络图构建 将雷公藤活性成分及潜在作用靶点在Excel 中构建对应关系，利用Cytoscpe3.7.2 软件绘制“药物活性成分-靶点”网络图。活性成分与靶点以“节点”表示，节点之间的相互作用以“边”表示。

1.4 蛋白互作网络图（PPI）构建 将雷公藤与PsA共同作用靶点导入STRING（http：//string-db.org）在线数据库，以置信度分数＞0.9 为条件筛选，将所得结果以文本形式结合Cytoscape3.7.2 软件，构建PPI网络图并获取核心靶点。

1.5 基因本体（GO）富集和京都基因与基因组数据库（KEGG）通路分析 将交集靶点导入DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp）数据库，以P＜0.05 为筛选条件，进行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，进一步阐明雷公藤治疗PsA 的作用机制。GO 富集分析主要用于描述基因靶点的功能，包括细胞组成、分子功能和生物过程；KEGG 富集分析可以得到雷公藤和PsA 共同靶点富集的主要信号通路。

1.6 活性成分与关键靶点的分子对接验证 从RCSB PDB 数据库（http：//www.rcsb.org/pdb）下载靶点蛋白的晶体结构，保存为PDB 格式，使用PyMOL软件去配体，再用AutoDock1.5.6 软件去水加氢分配原子，计算电荷，保存为PDBQT 格式，从TCMSP数据库下载化合物的三维结构，用CHEM3D 软件做力场分析，最小能量化，进行靶点蛋白与化合物的对接，使用Discovery2016 软件进行数据可视化。

2 结果

2.1 雷公藤活性成分 采用TCMSP 数据库进行筛选后，得到雷公藤活性成分51 个，删除重复化合物和无对应靶点的化合物，共获得28 个活性成分和132 个靶点。

2.2 PsA 疾病靶点 在疾病靶点数据库（GeneCards、OMIM、DrugBank）检索PsA 的作用靶点，删除重复值后，共计得到1 393 个靶点。并利用Venny2.1.0 软件绘制药物-疾病韦恩图，获得药物疾病交集靶点70 个，见图1。

图1 雷公藤-关节型银屑病韦恩图

2.3 雷公藤活性成分-靶点网络分析 运用Cytoscape3.7.2 软件构建化合物活性成分-靶点网络并进行拓扑分析，度值（Degree）越大的节点在网络中的重要性越大。结果显示，网络中有160 个节点，414 条边，见图2。其中Degree 值前5 名的活性成分为山奈酚、β-谷固醇、雷公藤甲素、诺必列汀和豆甾醇等。网络分析显示，雷公藤通过多成分、多靶点、多途径共同作用的方式发挥药效。

图2 活性成分-靶点网络图

2.4 PPI 网络图 将70 个共同靶点导入STRING数据库，根据设置参数，得到雷公藤治疗PsA 潜在靶点网络，将结果转换为文本格式，利用Cytoscape3.7.2 软件，运用Network Analyzer 插件进行拓扑分析，得到潜在靶点基因拓扑参数自由度，自由度表示节点所包含的边的数目，靶点自由度越大，表明通过改该靶点发挥作用的可能性越大。根据2 倍Degree 值（12），得到核心靶点有11 个，见表1，相互作用关系，见图3。

表1 核心靶点信息

图3 雷公藤治疗PsA 的PPI

2.5 GO 和KEGG 功能富集分析 在DAVID 数据库中对雷公藤和PsA 的共同靶点进行富集分析，P＜0.05 为筛选标准，结果显示，与生物过程（BP）相关条目270 个，主要涉及维生素D 生物合成过程的正调控、突触传递的负调节，多巴胺能、氮素利用的调节、神经胶质细胞增殖的调控等；与细胞成分（CC）相关条目29 个，主要涉及孔复合体、CD40 受体复合物、RNA 聚合酶Ⅱ转录因子复合物、膜筏、细胞器膜等；与分子功能（MF）相关条目57 个，主要涉及前列腺素-内过氧化物合酶活性、维生素D 24-羟化酶活性、9-顺式视黄酸受体活性、一氧化氮合酶活性、一氧化氮合酶调节剂活性等。以条形图展示，见图4。相同方法筛选KEGG 相关条目105 个，主要涉及癌症的途径、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、磷脂酰肌醇3 激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信号通路、Toll样受体（TLR）信号通路、HIF-1 信号通路、MAPK 信号通路、NF-κB 信号通路等，选取前20 个以气泡图可视化，见图5。

图4 雷公藤治疗PsA 的GO 富集分析

图5 雷公藤治疗PsA 的KEGG 富集分析

2.6 分子对接结果 根据度值选取山奈酚和雷公藤甲素与靶点二聚体转录因子（JUN）、肿瘤坏死因子（TNF）进行分子对接，结果显示结合能均为负值，表明受体与配体可以自发结合，能量＜-5 kcal/mol，提示二者之间有较强的结合活性，见表2，分子对接结果，见图6。

表2 活性成分与靶点受体蛋白间的结合能

图6 雷公藤治疗PsA 分子对接结果

3 讨论

关节病型银屑病，皮肤表现在中医上属于“白疕”范畴，关节表现在中医上属于“历节病”、“痹证”等范畴。致病原因多由机体阴阳失调，外邪侵袭所致。PsA 治疗的目的在于缓解疼痛和延缓关节进一步的破坏，同时兼顾治疗关节炎和银屑病皮损。传统中药雷公藤，味苦，有大毒，有活血化瘀、清热解毒、消肿散结等功效，药理研究证实，雷公藤有抗炎、抗肿瘤、免疫调节等多种药理活性[6]。Zhao 等[7]研究表明雷公藤通过抑制信号转导与转录激活因子3（STAT3）磷酸化而抑制辅助性T 细胞17（Th17）功能，可明显改善由咪喹莫特诱导的皮肤损伤。

本研究运用网络药理学的方法得到雷公藤治疗PsA 的关键活性成分有山奈酚、β-谷甾醇、雷公藤甲素和豆甾醇等，以上活性成分可能是雷公藤治疗PsA 的物质基础。山奈酚是天然的黄酮类化合物，有抗氧化、抗癌、抗炎等多种生物学活性[8-9]。Liu等[10]观察山奈酚能够降低银屑病型小鼠CD3+T 细胞的浸润，下调皮肤中的促炎性核转录因子κB（NFκB）的信号传导，在体外抑制T 细胞的增殖及丝氨酸蛋白激酶（mTOR）信号转导。β-谷甾醇属于植物甾醇的一种，有多种药理活性，有研究表明其在抗氧化、抗高血脂、抗炎和免疫调节等方面有诸多药理作用[11-12]。雷公藤甲素是中药雷公藤的主要活性成分之一，有免疫抑制、抗炎、抗生育及抗肿瘤等生物活性[13]。有研究表明，雷公藤甲素对银屑病有明显改善作用[14]。豆甾醇是一种植物甾醇，营养价值高，生物活性强，有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、降低胆固醇和改善记忆等生物活性[15]。

根据雷公藤蛋白互作网络图分析，雷公藤治疗PsA 的核心靶点有：STAT3、TNF、JUN、丝氨酸蛋白激活酶1（AKT1）、丝氨酸/苏氨酸激酶14、8（MAPK14、MAPK8）、人源重组蛋白（RELA）、TP53 基因、趋化因子8（CXCL8）、血管内皮生长因子（VEGFA）、核蛋白转录因子（FOS）。STAT3 为STAT 家族的一员，STAT3 的激活是由多种细胞因子和生长因子引起的，在成熟的吞噬细胞中，STAT3 抑制TLR 信号转导而抑制炎性反应[16]。TNF 超家族通路在细胞增殖、存活和死亡中起重要作用[17]。JUN 是一种二聚体转录因子，由c-JUN，c-Fos，和ATF 家族的蛋白质组成，TRPV1 刺激的细胞内功能依赖于刺激调节蛋白激酶和刺激反应性转录因子的激活[18]。AKT1 是AKT 在响应生长因子和其他细胞外刺激的信号通路中起着调节细胞功能的作用，包括营养代谢、细胞生长、细胞凋亡和存活[19]。MAPK 属于丝氨酸/苏氨酸激酶的大家庭，MAPK14 和MAPK8 属于其中一员，主要构成了从细胞表面到细胞核的炎性反应信号通路[20]。RELA 是NF-κB 的关键成员，对炎性反应环境至关重要[21]。据国外研究报告，磷酸二酯酶4 能抑制磷酸化的NF-κB 亚基p65 的易位，促进细胞核周期蛋白D1 积累的丢失和细胞周期抑制剂p21 的增加，依那西普能够使银屑病患者皮损磷酸化的RELA 显著下调，与表皮厚度减少，角质形成细胞分化相关[22-23]。研究显示VEGF 在关节病型银屑病患者中，其水平与红细胞沉降率（ESR）、健康评估问卷残疾指数（HAQ）、银屑病面积和严重程度指数（PASI）和视觉模拟评分法（VAS）呈正相关[24]。CXCL8 属于与血小板因子4 类似的结构相关的小型细胞因子家族，由吞噬细胞和间质细胞暴露于炎性刺激产生，并激活嗜中性白细胞诱导趋化性。

GO 功能富集分析显示，雷公藤治疗PsA 的基因功能主要体现在铁对翻译起始的正调控、维生素D 生物合成过程的正调控、神经胶质细胞增殖的调控、降钙素1-单加氧酶活性的正调控等；孔复合体、RNA 聚合酶Ⅱ转录因子复合物、膜筏、细胞器膜、核染色质等；前列腺素-内过氧化物合酶活性、维生素D 24-羟化酶活性、精氨酸结合、CCR5 趋化因子受体结合等。

KEGG 信号通路富集分析发现，雷公藤活性成分治疗PsA 的主要信号通路有：癌症的途径、TNF信号通路、PI3K-Akt 信号通路、Toll 样受体（TLR）信号通路、HIF-1 信号通路、MAPK 信号通路和NFκB 信号通路等。银屑病可能与患癌症的风险增加有关，与没有银屑病的患者比较，接受银屑病治疗的患者死于恶性肿瘤的风险增加41%[25]。TNF 及其超家族成员可以促进免疫细胞活性，限制炎性因子，TNF 阻滞剂在关节病型银屑病中可有效抑制炎性反应和减轻症状[26]。Chimenti 等[27]观察到赛妥珠单抗有效抑制人皮肤微血管内皮细胞血管生成黏附分子的表达，减少人皮肤微血管内皮细胞血管生成趋化因子的分泌，治疗关节病型银屑病效果明显。有国外报告显示，IL-9、IL-22 诱导的T 细胞增殖依赖于PI3K-Akt 通路，调节促炎因子[28-29]。TLR家族成员TLR7 和TIL8 拮抗剂对银屑病的治疗有较理想效果[30]。MAPK 激酶构成了3 个重要信号通路，p38，JNK，控制细胞增殖、分化，基因表达和细胞凋亡。表皮的广泛增殖失衡导致银屑病的发生[31]。Lories 等[32]报告显示依那西普治疗关节病型银屑病可导致NF-κB，JNK 和ERK 显著降低，但p38 激酶不会降低。

综上，雷公藤通过多基因、多通路、多靶点发挥治疗关节病型银屑病的作用，这与中药治疗疾病多靶点、多途径的特点是一致的。本研究利用网络药理学方法，系统分析了雷公藤治疗关节病型银屑病可能的作用机制，以期为中药新药的筛选和开发提供思路和方法。