大豆DHQ-SDH基因家族生物信息学分析

张安宁，毛庆丰，孙浩楠，申 晴，李志刚，刘中奇

（内蒙古民族大学农学院，内蒙古 通辽 028043）

大豆（Glycine max）起源于中国［1］，已有5 000多年的栽培历史［2］，春大豆主产区包括黑龙江、吉林、辽宁和内蒙古四省（区）［3］。大豆属于一年生草本植物［4］，具有很高的蛋白质含量与油含量［5-6］，是人类主要的粮食作物之一［7］。同时，大豆不仅可以作为食品的原材料，还可用于食用油的加工，并且加工所剩的豆饼可用于制作肥料［8-10］。大豆生长发育过程中需要芳香族类物质，而莽草酸途径作为芳香族类物质合成的必要途径，对大豆生长发育有重要作用。DHQ-SDH 是植物体内合成的、调节莽草酸途径的关键酶。一方面，可催化3-脱氢奎尼酸脱水形成莽草酸，另一方面，在NADP+存在的条件下催化3-脱氢莽草酸和莽草酸之间的可逆反应［11］。截至目前，已有学者对DHQ-SDH基因家族进行了相关研究。SINGH等［12］研究表明，拟南芥体内的DHQ-SDH蛋白为莽草酸途径中的代谢物分配提供了额外的调节水平，从而使代谢物从DHQ区域转移到SDH区域的效率提高。HAN等［13］首次报道冷胁迫对淡水绿藻DHQ-SDH基因的调控。目前，有关大豆DHQ-SDH基因家族的研究少有报道，笔者通过生物信息学方法，对大豆DHQSDH基因家族成员的理化性质、基因架构、保守基序、系统发育进化树等进行了预测与分析，旨为日后大豆DHQ-SDH基因的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

所使用的拟南芥DHQ-SDH蛋白序列、番茄DHQ-SDH蛋白序列以及大豆全基因组Glycine maxv2.1数据均来源于Ensembl（http：//plants.ensembl.org/index.html）数据库［14］。

1.2 大豆DHQ-SDH基因家族的鉴定

将拟南芥DHQ-SDH序列作为对照，利用Tbtools软件［15］进行blast比对，将筛选得到的候选序列上传至在线网站Pfam（http：//pfam.xfam.org/）［16］检查是否含有DHQas_1序列，最终得到全部大豆DHQ-SDH基因家族成员。使用Expasy（https：//web.expasy.org/protparam/）在线软件［17］预测家族成员蛋白质的理化性质，利用WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）在线网站［18］对其家族成员蛋白质进行亚细胞定位预测。

1.3 染色体位置与基因结构分析

根据大豆基因注释文件可获得GmDHQ-SDH家族的13个成员在染色体上的位置信息及基因结构信息，使用Tbtools软件［15］实现染色体定位与基因结构的可视化。

1.4 大豆DHQ-SDH蛋白质的二级结构和三级结构分析

使用SOPMA（https：//hfffg35d63ad69a164cc2swoc6n65wcbov6k6vfgfy.eds.tju.edu.cn/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）网站［19］和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）网站［20］预测大豆DHQSDH基因家族成员蛋白质的二级结构以及三级结构，通过PROCHECK软件［21］完成三级结构可靠性的检测。

1.5 大豆DHQ-SDH蛋白质的保守基序分析

利用Tbtools［15］软件预测大豆DHQ-SDH蛋白的保守基序，并进行可视化。

1.6 大豆DHQ-SDH基因家族系统发育进化树的构建

于Ensemble（http：//plants.ensembl.org/index.html）数据库［14］下载拟南芥和番茄的DHQ-SDH蛋白质序列（分别为1 个和2 个），将拟南芥和番茄2 个物种的DHQ-SDH 蛋白质序列（3 个）与所提取到的大豆DHQ-SDH蛋白质序列通过MEGA11软件［22］进行系统发育树的构建，并使用iTOL（https：//itol.embl.de/）在线网站［23］美化进化树。

1.7 大豆GmDHQ-SDH基因的转录后调控预测

利用Tbtools［15］筛选大豆DHQ-SDH基因家族成员的CDS 序列，将筛选出的序列上传至psRNATarget（https：//www.zhaolab.org/psRNATarget/home）在线软件［24］，预测大豆GmDHQ-SDH基因的miRNA。

1.8 大豆DHQ-SDH基因家族启动子顺式作用元件分析

通过Tbtools软件［15］从基因组文件中提取得到GmDHQ-SDH基因家族成员的上游2kb序列。将提取得到的序列上传至PlantCARE（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）网站［25］进行分析，最终使用Tbtools软件［15］进行启动子顺式作用元件分布的可视化。

2 结果与分析

2.1 GmDHQ-SDHs基因家族成员鉴定

共鉴定出DHQ-SDH基因家族成员13个，将其命名为GmDHQ-SDH1至GmDHQ-SDH13。并对家族成员进行蛋白质理化性质分析，其中，氨基酸数量位于409～577之间；分子量为44.36～62.98 kD；不稳定系数介于23.32～32.03 之间；等电点为5.26～6.77；除GmDHQ-SDH1、GmDHQ-SDH3、GmDHQ-SDH13 外，其余蛋白均属于疏水蛋白，而且，大豆DHQ-SDH家族成员均具有较好的热稳定性，分别位于叶绿体、过氧物酶体与胞液中。

表1 GmDHQ-SDHs蛋白理化性质及亚细胞定位Tab.1 Physicochemical properties and subcellular localization by GmDHQ-SDHs protein

2.2 大豆DHQ-SDH家族基因染色体定位和基因结构分析

GmDHQ-SDHs家族成员共分布在5条染色体上，且分布具有随机性。GmDHQ-SDH13与GmDHQ-SDH12分布在1号染色体上，GmDHQ-SDH2位于19号染色体，GmDHQ-SDH1位于20号染色体，GmDHQ-SDH3分布在8号染色体上，分布在3号染色体上的基因最多，为GmDHQ-SDH4～GmDHQ-SDH11（图1）。

图1 大豆GmDHQ-SDHs基因染色体定位Fig.1 Chromosome localization of GmDHQ-SDHs gene in soybean

GmDHQ-SDH4、GmDHQ-SDH5、GmDHQ-SDH6、GmDHQ-SDH7、GmDHQ-SDH12以及GmDHQ-SDH13均含有上下游非编码区域，GmDHQ-SDH1具有下游非编码区域，而其他GmDHQ-SDHs家族成员不具备上下游编码区域。同时，该家族成员所包含的内含子数量介于7～11 个之间，表明其在结构上很保守，其中，GmDHQ-SDH3的内含子最长（图2）。

图2 GmDHQ-SDHs基因家族染色体结构图Fig.2 Chromosome structure of GmDHQ-SDHs gene family

2.3 二级结构和三级结构分析

大豆DHQ-SDH基因家族成员蛋白质的二级结构中含有α-螺旋、β-折叠、延伸链与随机卷曲。所有成员均以α-螺旋为主，其中，GmDHQ-SDH9中的α-螺旋所占比例最大，为48.33%；随机卷曲为第二主要结构，所占比例介于29.76%～34.84%之间（表2）。GmDHQSDH基因家族13 个家族成员的三级结构具有很高的相似性，而且均以α-螺旋为主（图3）。GmDHQ-SDH1至GmDHQ-SDH13的模型氨基酸在最佳允许区和次允许区的比例介于97.7%～100%之间，所以构建的GmDHQ-SDH1～GmDHQ-SDH13的蛋白三级结构符合立体化学规则。

图3 大豆DHQ-SDH基因家族三级结构预测图Fig.3 The tertiary structure prediction map of DHQ-SDH gene family in soybean

表2 GmDHQ-SDHs基因家族二级结构Tab.2 Secondary structure of GmDHQ-SDHs gene family

2.4 大豆DHQ-SDH家族成员保守性分析

GmDHQ-SDHs家族成员共分为4个组（分别为Group1～Group4）。Group1中GmDHQ-SDH4和GmDHQSDH5亲缘关系较近，GmDHQ-SDH8和GmDHQ-SDH9亲缘关系较近；Group2中，GmDHQ-SDH7与GmDHQ-SDH11亲缘关系较近；Group4中，GmDHQ-SDH12和GmDHQ-SDH13亲缘关系较近。见图4（A）。

图4 GmDHQ-SDHs基因家族保守基序Fig.4 Conserved motifs of GmDHQ-SDHs gene family

GmDHQ-SDHs家族成员蛋白均包含Motif1～Motif6，而且Motif1～Motif6 共同组成了DHQas_1 结构域。同时，GmDHQ-SDH10、GmDHQ-SDH8、GmDHQ-SDH9、GmDHQ-SDH11和GmDHQ-SDH3不具有构成SDH_C结构域的Motif9，见图4（B）、图4（C）。

2.5 大豆DHQ-SDH家族进化分析

使用2个拟南芥DHQ-SDH蛋白序列、2个番茄DHQ-SDH蛋白序列与13个大豆DHQ-SDH蛋白序列构建系统发育树（图5）。其中，Group2 由At3g06350、Solyc01g067750、GmDHQ-SDH1、GmDHQ-SDH3、GmDHQSDH12、GmDHQ-SDH13构成，由此说明，这6条蛋白序列具有很高的保守性。而在Group3中，GmDHQ-SDH2、GmDHQ- SDH4、GmDHQ- SDH5、GmDHQ- SDH6、GmDHQ- SDH7、GmDHQ- SDH8、GmDHQ- SDH9、GmDHQ-SDH10、GmDHQ-SDH11聚在一起，说明这些蛋白序列亲缘关系较近。

图5 拟南芥、番茄、大豆DHQ-SDH基因家族进化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of DHQ-SDH gene family in arabidopsis，tomato and soybean

2.6 大豆GmDHQ-SDHs家族基因的转录后调控分析

使用psRNATarget（https：//www.zhaolab.org/psRNATarget/home）在线软件预测大豆GmDHQ-SDH基因的miRNA，结果得到127 对调控关系，共有2 种抑制靶基因的方式，分别为剪切和翻译，其中，调控GmDHQ-SDH12与GmDHQ-SDH13的miRNA 均有23 个，为所有大豆GmDHQ-SDH基因中数量最多者。调控GmDHQ-SDH3、GmDHQ-SDH4、GmDHQ-SDH6、GmDHQ-SDH9和GmDHQ-SDH11的miRNA 数量均为7个；调控GmDHQ-SDH7、GmDHQ-SDH5的miRNA为6个；调控GmDHQ-SDH1、GmDHQ-SDH8和GmDHQ-SDH10的miRNA 均为8 个；调控GmDHQ-SDH2的miRNA 数量为10 个。将数学期望值设定为5.0，共筛选得到16 对GmDHQ-SDH12、GmDHQ-SDH13和miR9746 家族之间的调控关系，miR9746 家族成员共有8 个，分别为gma-miR9746a、gma-miR9746b、gma-miR9746c、gma-miR9746d、gma-miR9746e、gma-miR9746f、gma-miR9746g 以及gma-miR9746h，8 个家族成员分别与GmDHQ-SDH12和GmDHQSDH13有1对对应关系。见表3。

表3 靶向调控大豆GmDHQ-SDH基因的miRNATab.3 miRNA targeting GmDHQ-SDH gene in soybean

2.7 GmDHQ-SDHs家族成员启动子区顺势作用元件分析

13个家族成员的顺式作用元件无论在类别或数量上均存在差异，其中，光响应元件在所有元件中出现的频率最高，据此推测大豆的DHQ-SDH基因在大豆生长发育响应光调控的过程中具有重要作用。此外，鉴定出的生长发育调控响应包括胚乳表达响应元件、分生组织表达响应元件和栅栏叶肉细胞响应元件。而且，在启动子区鉴定出了逆境胁迫响应元件，其中包括低温响应元件、干旱响应元件、厌氧感应元件，表明在受到这些胁迫时，响应元件会提高植株自身的抵抗能力。鉴定出的激素应答响应元件共有4种，数量由多至少依次为脱落酸响应元件、茉莉酸甲酯响应元件、生长素响应元件、水杨酸响应元件。见图6。

图6 GmDHQ-SDHs基因启动子区顺势作用元件分析Fig.6 Analysis of cis-acting elements in the promoter region of GmDHQ-SDHs gene

3 讨论与结论

DHQ-SDH可以促进莽草酸的合成［26］。据报道，烟草DHQ-SDH基因可能参与碳源向次生代谢的运输［27］。笔者通过生物信息学方法共鉴定出13个大豆DHQ-SDH基因家族成员，大豆DHQ-SDH基因家族成员蛋白的理化性质和亚细胞定位分析显示，GmDHQ-SDH 蛋白均属于稳定蛋白，且大部分为疏水蛋白，分别位于叶绿体、过氧物酶体和胞液中，该结果与王梅等［28］在巨尾桉EuDQD/SDH5中发现的类似。保守基序分析表明，大豆DHQ-SDH基因家族成员共分为4 组，因为处于同一组中的家族成员亲缘关系较近，所以猜测GmDHQ-SDH4和GmDHQ-SDH5亲缘关系较近，GmDHQ-SDH8和GmDHQ-SDH9亲缘关系较近，GmDHQ-SDH7与GmDHQ-SDH11亲缘关系较近，GmDHQ-SDH12和GmDHQ-SDH13亲缘关系较近，而且，该家族成员均包含DHQas_1 结构域，说明其保守性很高，与SINGH 等［12］的研究结果相同。但是有些成员不具备构成SDH_C 结构域的Motif9，说明GmDHQ-SDH也具有很高的功能多样性。系统进化分析结果表明，At3g06350、Solyc01g067750、GmDHQ-SDH1、GmDHQ-SDH3、GmDHQ-SDH12、GmDHQ-SDH13位于同一组别，由此推测上述基因具有相似功能。基因结构分析表明，所有家族成员含有的内含子数量为7～11 个，其中，GmDHQ-SDH3的内含子最长。顺式作用元件分析表明，大豆DHQ-SDH基因家族成员启动子区的顺式作用元件共分为4类（光响应元件、逆境胁迫响应元件、激素应答响应元件、生长发育调控响应元件），其中，光响应元件出现频率最高，据此推测大豆GmDHQ-SDH基因在大豆植株成长时对光的变化能够迅速地做出响应。与此同时，鉴定出了逆境胁迫响应元件，HAN等［13］研究发现，低温可诱导淡水绿藻水绵DHQ-SDH基因家族成员上调表达。该家族成员具有的激素应答响应元件能够响应茉莉酸甲酯、脱落酸、水杨酸、赤霉素以及生长素，推测GmDHQ-SDH可以通过响应以上激素应答，参与调控非生物胁迫，从而增加植株对逆境的耐受能力。张林等［11］在烟草中发现NtDHQ-SDHs除具备上述元件外，还具有组成型原件，所以推测DHQ-SDH基因具有更丰富的功能。