一种运用病理切片技术制作脱细胞支架的简易方法

陈 菲,李 丽,包春娟

细胞外基质(extracellular matrix, ECM)是一种由细胞分泌到胞外间质构成3D复杂网架结构的大分子物质,主要作用是支持和连接组织的结构及调节细胞的生理活动,其主要成分聚糖和纤连蛋白构成结构支架[1]。组织经过复杂的脱细胞过程可获得天然的ECM支架,常用于组织工程学与再生医学的器官重建。作为肿瘤微环境的重要组成部分,目前ECM成为研究热点,但有关肿瘤ECM的制备鲜有报道,主要原因是样本量少、制作难度大。目前,组织脱细胞方法有物理、化学和酶解等方法。本文介绍一种冷冻切片联合石蜡切片,使用化学方法制作脱细胞支架材料的简单方法,效果较好,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与设备人肝肿瘤(含癌旁)组织(样本通过四川大学华西医院生物标本库申请,本研究所使用的患者信息和生物样本均获得患者本人或直系亲属的同意,相关实验经四川大学华西医院伦理委员会审核批准)、冷冻组织OCT包埋剂(epredia NEG50)、一次性刀片(epredia MX35 Ultra)、苏木精(epredia Hematoxylin 7211)、伊红(epredia 7111)、天狼星红试剂盒(Sbjbio BP-DL030)、柠檬酸组织抗原修复液(福州迈新MVS-0101)、羊血清(北京中杉金桥公司,#ZLI-9021)、驴血清(ImmunoReagents,#SP-072-VX2)、兔/鼠通用型免疫组化检测试剂盒(Dako K5007)、Fibronectin抗体(ab2413)、Collagen Ⅰ抗体(ab34710)、Alexa Fluor594 donkey anti-rabbit IgG(invitrogen A21207)、DAPI(sigma D9542)、防淬灭封片剂、冷冻切片机(epredia NX70)、石蜡切片机(epredia HM340E)、自动封片机(epredia Clearvue)、光学显微镜(Olympus BX51)、荧光显微镜(Leica 2000B)。

1.2 方法

1.2.1冷冻切片 将人肝肿瘤(含癌旁)组织切成大小1.5 cm×1.5 cm×1 cm(长×宽×高)的块状(如样本小于该尺寸则不再修取),冷冻托盘涂抹少量OCT包埋剂后将组织黏合、冷冻;设置冷冻切片机温度(样本头温度-5 ℃,刀架温度-25 ℃,切片厚400 μm),进行冷冻切片(图1),依次将切好的样本放入6孔板内(图2),直至组织切完。在培养皿(直径×高为10 cm×2 cm)内加入0.1%曲拉通(Triton X-100)工作液摇床震荡3 h(80 r/min)、去离子水摇床震荡3 h、0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)工作液摇床震荡6 h、去离子水摇床震荡3 h、0.1%Triton X-100工作液摇床震荡3 h、去离子水摇床震荡3 h、PBS摇床震荡3 h。

1.2.2石蜡包埋和切片 选取1片脱细胞组织(图3)放入垫硬纸板的包埋盒中,展平、加盖,放入10%中性福尔马林固定48 h,将样本放入全自动脱水机中进行脱水、透明、浸蜡处理(程序设置:55%乙醇、65%乙醇、75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、95%乙醇、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ各30 min,二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ各10 min,57 ℃石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ、石蜡Ⅲ分别为15、30、30 min),石蜡包埋(图4)、石蜡切片厚度为4 μm,贴于黏附载玻片上备用。

1.2.3常规HE、天狼星红染色、免疫组化和免疫荧光染色 (1)HE染色:脱蜡后将切片放入苏木精染液中3 min,1%盐酸乙醇分化,流水返蓝,伊红染色30 s,依次从80%乙醇、95%乙醇、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ脱水和分色,二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明,Clearvue自动封片机封片。(2)天狼星红染色:将切片脱蜡后滴加天狼星红染液200 μL,常温放置30 min,蒸馏水稍洗,常规脱水透明、封片。(3)免疫组化染色(本实验采用EnVision两步法):脱蜡后的切片放入柠檬酸组织抗原修复液中,95 ℃水浴20 min,待冷却后PBS清洗,0.3%H2O2孵育15 min阻断过氧化物酶,清洗后甩掉组织周围液体(组织切勿干燥),滴加10%羊血清和10%驴血清等体积混合液200 μL[2],室温封闭20 min,甩掉后直接在组织上滴加200 μL一抗Fibronectin(稀释比1 ∶100)工作液,4 ℃冰箱孵育过夜后PBS清洗,在组织上滴加200 μL兔/鼠通用型免疫组化检测试剂盒中的二抗(ChemMate EnVision+HRP),37 ℃孵育45 min,清洗后滴加显色剂DAB工作液200 μL,光镜下控制显色,苏木精复染,梯度乙醇脱水、二甲苯透明、Clearvue自动封片机封固。(4)免疫荧光染色:脱蜡后的切片放入柠檬酸组织抗原修复液中,90 ℃水浴20 min,待冷却后PBS清洗,滴加10%羊血清和10%驴血清等体积混合液200 μL,室温封闭20 min,甩掉后直接在组织上滴加200 μL一抗Collagen Ⅰ(稀释比1 ∶200)工作液,4 ℃冰箱孵育过夜后PBS清洗,避光滴加200 μL二抗Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG(稀释比1 ∶500),37 ℃孵育45 min,清洗后滴加200 μL DAPI,5 min后清洗3次,缓冲甘油封片。

2 结果

人肝肿瘤组织经脱细胞化处理后,HE染色中细胞核无苏木精着色,间质呈红色(图5);天狼星红染色可见大量胶原纤维成分,呈亮红色(图6);免疫组化Fibronectin抗体验证了大量纤连蛋白的存在,呈棕黄色网状分布(图7);免疫荧光Collagen Ⅰ抗体呈红色丝状广泛分布(图8)。脱细胞处理前人肝脏组织(对照组)经DAPI染色,细胞核呈蓝色球状分布(图9);脱细胞后经DAPI染色已无蓝色细胞核存在(图10)。本组实验结果显示,新鲜组织冷冻后切成厚薄均一的片状,经脱细胞处理联合使用石蜡包埋切片的方法,最终采用多种病理染色方法验证,脱细胞支架结构保持完整且染色效果良好。

3 讨论

目前肿瘤仍是威胁人类健康的主要问题之一,据世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)公布的2020年度全球最新癌症数据显示,我国已成为“癌症大国”,新发病例和死亡人数均位居全球首位。进一步完善肿瘤进展和转移的分子机制,有助于我们更深入地了解其生物学行为,同时为肿瘤患者的治疗寻找新的契机。肿瘤微环境是由肿瘤细胞与免疫细胞、间质细胞、血管、淋巴管以及各种信号分子和ECM相互作用而形成的一个复杂的综合系统[3]。ECM作为肿瘤微环境的重要组成部分,在肿瘤的全生命周期中扮演着重要角色[4]。通过对ECM的降解与重塑,改变其蕴含的生物物理和生物化学信号,进而为肿瘤的发展和侵袭奠定条件[5]。研究ECM在原发性肝细胞癌中的动态演变历程,对完善肿瘤进展转移的分子机制以及探索新型诊断和预后评估指标具有重要意义。相比传统的二维细胞培养,对于涵盖复杂信号通路的三维体内环境无法真实呈现。因此,保留天然的ECM并在其上培养细胞乃至类器官的优势凸显,完全实现体内微环境的模拟[6]。由于物种间存在差异和研究的深入,动物脱细胞支架已无法满足人体内环境的模拟;而人体组织或器官稀缺不易获取,因此有关人脱细胞支架的报道并不多见。对于完整或较大的实质性器官(如大鼠肝脏、肾脏,人脂肪肝[7-9]等)脱细胞支架材料的制备,通常运用蠕动泵等设备进行灌注、结合冻融及化学脱细胞处理;对于空腔器官组织(如猪结肠、血管、胆总管[10-12]等)脱细胞支架材料的制备,通常使用化学脱细胞和浸泡震荡的方法进行处理;另有文献报道,使用切肉机将猪肝脏组织切成2 mm厚的切片,酶解联合化学和浸泡振荡方法处理[8],而对于临床实质性器官的肿瘤类手术样本,考虑到体积小不宜使用插管灌注法,也不宜使用简单的直接浸泡震荡法,更无法使用如手动切肉机这样的设备将组织进行厚切片,只能另辟蹊径寻求其他方案。本文介绍的将人肝肿瘤组织冷冻切片再进行脱细胞处理的方法,优势在于其可以最大限度地保存样本体积、切片连续且厚度均一,操作便捷。如何获得理想效果总结如下:(1)将新鲜组织置于常温软化,在冷冻切片机底部涂抹少量的冷冻组织OCT包埋剂将其黏附在托盘上即可,避免包埋剂使用过量。(2)冷冻切片机的最佳温度应调至样本头温度为-5 ℃、刀架温度为-25 ℃,样本头温度过高会导致组织黏附在切片板上皱缩,温度过低会导致组织变硬、变脆断裂;刀架温度可以设置低温,保证切片完整且连续。(3)组织脱细胞时应注意充分震荡,及时观察样本是否已经变为白色半透明状,后期可行相关病理检测来验证脱细胞的效果和成分。(4)本文选用其中的1片脱细胞支架即可进行石蜡包埋及一系列的病理相关检测,剩余脱细胞支架可继续做体外细胞培养、质谱成像检测等相关研究。目前本科室冷冻切片机的最大切片厚度为400 μm,实验中作者尝试用100 μm、200 μm、300 μm和400 μm厚度的组织切片,结果发现400 μm厚度的组织切片效果适宜,不仅能够彻底脱细胞,仅1张ECM支架材料就能够满足石蜡多张切片需求,最大程度节省了手术样本的损耗。目前本科室已顺利完成20余例手术样本的脱细胞支架实验并获得研究者的认可,该方法可推广应用。