奥拉西坦对尼莫地平大鼠体内药动学影响

张在美 周伟 付常芳 李玉琴

1. 山东第一医科大学（山东省医学科学院）药学院，山东 济南 250117；2. 沈阳药科大学药学院，辽宁 沈阳 117004； 3. 菏泽卫生学校医药技术系，山东 菏泽 274000

血管性痴呆是由脑血管病变或血管危险因素引起的脑损伤所导致的痴呆，主要表现为记忆丧失、认知能力严重减退，严重影响患者的正常生活［1-2］。研究认为，血管性痴呆的发生与脑组织中胆碱能系统功能异常、突触改变、血管相关基因异常等有关［3］。目前尚未上市治疗血管性痴呆的特效药，临床上常用尼莫地平、奥拉西坦和盐酸多奈哌齐等药物改善血管性痴呆患者的症状。但血管性痴呆发病机制复杂，单一用药存在起效较慢，疗效较差等缺点，因此常采用联合用药的方式治疗血管性痴呆。

根据这种分配模式，引用链末端的最终获奖方案的作者将获得该方案全部奖金的1/3，剩余2/3则被链上所有作者(包括最终获奖方案作者)均分。如果一个作者重复出现在不同的链环中，则其奖金数额将被累加。

航飞数据获取后，采用内业数据处理软件如Pix4Dmapper、ContextCapture等进行无人机数据处理，主要流程为：导入航飞的原始影像数据、POS数据，进行影像预处理，修正影像畸变和相机检校；自动进行连接点提取和自由网平差，进行影像相对定向；加入外业控制点，进行区域网平差、纠正，进行绝对定向；生成正射影像图(DOM)、数字表面模型(DSM)、点云、实景三维模型等数据；数字高程模型(DEM)、数字线划图(DLG)则要借助立体测图软件、地理信息系统软件以及外业调绘等进一步生产。无人机航测内业数据生产流程，如图2所示。

尼莫地平作为二氢吡啶类钙通道阻滞剂，通过阻断钙离子内流从而发挥扩张血管、解除血管痉挛的作用［4］。尼莫地平的脂溶性较强，可通过血脑屏障，对脑血管具有较强的选择性，因此尼莫地平可调节脑血流量，改善脑血液循环，从而改善脑神经状态［5］。奥拉西坦作为神经营养性药物，对神经细胞的存活具有调节作用，其可促进神经生长，恢复神经功能，并可通过激动乙酰胆碱系统，提高脑部代谢功能，促进脑神经细胞的修复和激活［6］。

式中：Δy为屈服位移，用能量法确定[10]；Δu为极限位移，取骨架曲线上水平荷载下降至最大荷载的85%时对应构件的位移.

有研究比较了尼莫地平单独给药与奥拉西坦联用尼莫地平两种不同治疗方案下患者的认知水平、痴呆程度、日常生活能力、氧化应激水平、血液流变学等指标，结果表明奥拉西坦与尼莫地平联合给药治疗血管性痴呆效果优于尼莫地平单独给药［7-8］。但目前有关奥拉西坦对尼莫地平药动学影响的相关研究未见报道。因此，本实验拟建立测定大鼠血浆中尼莫地平含量的超高效液相色谱（ultra performance liquid chromatography， UPLC）法，并研究奥拉西坦对尼莫地平在大鼠体内药动学影响，以期为临床上两药的合理联用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

1.4.5 稳定性 取大鼠空白血浆100 μL，分别精密加入“1.3.1”尼莫地平系列工作液100 μL，配制成低、中、高（100、500、3 000 mg·L-1） 3个质量浓度的血浆样品，考察在自动进样室8 h、-20 ℃冻融循环3次、-20 ℃放置7 d的稳定性。

1.1.2 实验仪器 Waters Acquity UPLC H-class超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；KQ3200 E型数控超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；SHIMUADZU AUW220D电子天平（日本岛津公司）；Thermo Scientific Fresco21微量离心机（赛默飞世尔科技中国有限公司）；XW-80A旋涡混合仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；HP-5016SY氮吹仪（上海济成分析仪器有限公司）。

1.1.3 实验试剂 尼莫地平对照品（100 mg∕支，批号112886，南京森贝伽生物科技有限公司）；尼莫地平原料药（纯度98%，批号C12229356，上海麦克林生化科技有限公司）；奥拉西坦原料药（纯度95%，批号K1816245，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；羧甲基纤维素钠（纯度99%，批号140701，重庆天润生物制品有限公司）；甲醇（赛默飞世尔科技中国有限公司）；乙腈（赛默飞世尔科技中国有限公司）；甲酸（上海麦克林生化科技有限公司）。

作为首家进入云南的外资法人银行分行，恒生银行昆明分行早在2008年11月就已开业，这也是恒生银行在西部地区设立的首家分行。随后几年，汇丰银行（中国）有限公司昆明分行、东亚银行昆明分行、渣打银行（中国）有限公司昆明分行等相继开业。

林德认为，国际贸易是国内贸易的延伸，产品的出口结构、流向及贸易量的大小决定于本国的需求偏好，而一国的需求偏好又决定于该国的平均收入水平。这是因为三个方面的原因：

1.2 色谱条件

1.3.3 尼莫地平灌胃液的配制 精密称取尼莫地平原料药0.1 g，置于10 mL棕色容量瓶中，加入适量0.5%羧甲基纤维素钠溶液，定容至刻度，充分振摇，使尼莫地平均匀地分散于0.5%羧甲基纤维素钠溶液，得10 g·L-1尼莫地平灌胃液，在4 ℃下冷藏备用。

1.3 溶液配制及血浆样品处理

1.3.1 尼莫地平对照品溶液配制 精密称取尼莫地平对照品10 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，用适量甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，得200 μg·mL-1尼莫地平对照品溶液。精密量取尼莫地平对照品溶液适量，将其用甲醇分别稀释成浓度为50、100、200、500、1 000、3 000、5 000 mg·mL-1的对照品工作液。以上溶液均于4 ℃下冷藏保存备用。

1.3.2 0.5%羧甲基纤维素钠溶液的配制 精密称取羧甲基纤维素钠0.5 g，置于100 mL容量瓶中，用适量热水溶解，冷却到室温，用纯水定容至刻度，摇匀，得0.5%羧甲基纤维素钠溶液，在4 ℃下冷藏备用。

使用Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm × 100 mm， 1.7 μm），0.1%甲酸水-乙腈（40∶60）作为流动相，检测波长235 nm，柱温35 ℃，进样室温度10 ℃，进样量2 μL，流速0.25 mL·min-1。

1.4.3 精密度 取大鼠空白血浆100 μL，分别精密加入“1.3.1”项下尼莫地平系列工作液100 μL，配制成低、中、高（100、500、3 000 mg·L-1） 3个质量浓度的血浆样品，按照“1.3.5”项下处理后，按照“1.2”项下色谱条件，测定尼莫地平的峰面积，考察日内精密度，连续测3 d，考察日间精密度。

1.3.5 血浆样品处理 取100 μL大鼠空白血浆置于具塞离心管中，加入300 μL甲醇，涡旋2 min，于4 ℃，13 000 r·min-1下离心10 min，取上清液于离心管中，在40 ℃水浴中用温和氮气吹干，加100 μL甲醇复溶，涡旋2 min，于4 ℃，13 000 r·min-1下离心10 min后，将上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤后，进样分析。

1.4 方法学验证

1.4.1 选择性 取100 μL大鼠空白血浆，加入“1.3.1”项下尼莫地平对照品溶液适量，配制成500 mg·L-1的模拟血浆样品，将空白血浆样品、模拟血浆样品和大鼠灌胃给药后0.5 h的血浆样品，按照“1.3.5”项下方法处理后，按照“1.2”项下的色谱条件进行测定，记录色谱图。

1.4.2 标准曲线与定量下限 分别于100 μL大鼠空白血浆加入“1.3.1”项下尼莫地平系列工作液100 μL，再加入200 μL甲醇后，其余按“1.3.5”项下方法处理，得到尼莫地平浓度分别为50、100、200、500、1 000、3 000、5 000 mg·L-1的血浆样品溶液，照“1.2”项下色谱条件，记录色谱图与峰面积，以血浆中尼莫地平浓度为横坐标（X），以尼莫地平峰面积为纵坐标（Y），用加权最小二乘法（权重w = 1∕X2）进行线性回归，得到标准曲线方程。

每一个分布式的标准RFID网关最多可连接两个Q80U读写头，并设置4路I/O信号接口，从而将光电开关等传感器信号就近接入，以便系统对RFID读写头实现精细化控制。

1.3.4 奥拉西坦灌胃液的配制 精密称取奥拉西坦原料药1.25 g，置于25 mL棕色容量瓶中，用适量生理盐水溶解后定容至刻度，摇匀，得50 g·L-1奥拉西坦供试品试液，在4 ℃下冷藏备用。

除社会环境外，家庭环境对当代大学生就业观念的形成也具有重要影响。家庭是学生学习生活的重要场所，父母是学生人生道路上的第一任指导老师，大学生的就业观念极易受到家庭教育观念及家长教育思想的影响。由于大学生涉世未深，对社会就业实践也缺乏一定经验，在进行就业选择的时候，往往会在很大程度上听取家长的意见。现实当中，即使部分学生没有征求家长的意见，大多数家长也会干预学生的就业选择，而不同家庭的教育背景及文化程度等都会给大学生就业观的形成带来直接性影响。

1.4.4 提取回收率 取3份大鼠空白血浆100 μL，分别精密加入“1.3.1”项下尼莫地平系列工作液100 μL，配制低、中、高（100、500、3 000 mg·L-1）浓度的血浆样品，按“1.3.5”项下处理后，照“1.2”项下色谱条件，测定血浆样品中尼莫地平的峰面积 A；另取低、中、高（100、500、3 000 mg·L-1）浓度的尼莫地平对照溶液，照“2.2”项下色谱条件，测定峰面积 B，提取回收率= A∕B × 100%。

1.1.1 实验动物 清洁级SD雄性大鼠，体质量230 ～ 250 g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供［许可证号SCXK（辽）2020-00001］。

1.5 药动学

使用DAS 2.0药动学分析软件，采用统计矩模型，对药动学参数进行拟合处理，结果以表示。使用SPSS 26.0 软件对两组间药动学参数的均值进行独立样本t检验分析。检验水准α= 0.05。

1.5.2 血浆样品测定和数据处理 将“1.5.1”项下于不同时间点采集的血浆样品，按照“1.3.5”项下方法处理，按照“1.2”项下条件进行测定，记录血浆中尼莫地平峰面积。将血浆中尼莫地平峰面积代入标准曲线方程，计算得到不同时间点血浆中尼莫地平的浓度。以时间为横坐标，以血浆中尼莫地平的浓度为纵坐标，绘制血药浓度-时间曲线。

1.6 数据处理与统计学分析

1.5.1 给药方案和血浆样品采集 健康雄性SD大鼠12只，随机分成尼莫地平组（对照组）和奥拉西坦联用尼莫地平组（联合用药组），每组6只。对照组灌胃生理盐水，联合用药组灌胃奥拉西坦200 mg·kg-1，连续7 d。第7天给药完成后，各组均禁食不禁水。第8天常规给药后，立即灌胃尼莫地平（20 mg·kg-1），于给药后0.083、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12、24 h经眼内眦取血，置于含有肝素的离心管中，于4 ℃，3 000 r·min-1离心10 min，吸取上清于离心管中，于-20 ℃冷冻保存。

教育心理学告诉我们，相容的师生关系直接影响着学生的学习情绪，师生心理相容能提离教学效果。学生喜欢这位老师，就相信老师讲授的道理，愿意学习老师讲授的知识，自然就对老师讲的课表现出浓厚的兴趣，这就是我们常说的”爱屋及乌”。相反，如果学生不喜欢，甚至害怕这位老师，要想他们对这位老师所授的课程感兴趣是很困难的。可见，激发学生的学习兴趣，必须在教学中培养学生对老师的亲切感，创造一个师生心理相容的良好环 境。教师要做学生的知心朋友，建立起相互信任、尊重、帮助、团结、友爱、共同进步的良好关系。学生亲其师，才能信其道，乐其道。

2 结果与分析

2.1 方法学验证

2.1.1 专属性 选择性结果如图1所示，尼莫地平峰形较好，血浆中的内源性物质不干扰尼莫地平的测定，表明分析方法的专属性良好。

图1 尼莫地平专属性色谱图

2.1.2 标准曲线与定量下限 线性回归结果如图2所示，回归方程为Ŷ = 26.061X－307.974，R2=0.991，标准曲线各浓度点的计算值与标示值之间的偏差在±15%以内，定量下限的偏差在±20%以内。结果表明，尼莫地平在50 ～ 5 000 mg·L-1浓度范围内与其峰面积线性关系良好，其中尼莫地平的定量下限为50 mg·L-1。

所有人都唏嘘起来。细婆把面放在桌上，对阿东说：“给阿里宵个夜。这伢伤了心。”金妞也叫着：“阿里哥哥，明天跟我玩哦!”老巴向邻居们的关心表达着谢意，一一送他们出门。

图2 线性回归图

2.1.3 精密度 精密度结果如表1所示。结果表明，尼莫地平低、中、高（100、500、3 000 mg·L-1） 3个浓度质控样品的日内、日间精密度的相对标准偏差(relative standard deviation， RSD)均在15%的范围内，表明该分析方法的精密度良好。

表1 尼莫地平精密度考察结果

2.1.4 提取回收率 尼莫地平低、中、高（100、500、3 000 mg·mL-1） 3个浓度质控样品的提取回收率结果如表2所示，各浓度的质控样品的提取回收率在83.53% ～ 87.52%范围内，RSD ＜ 15%，尼莫地平的提取回收率较高。

表2 尼莫地平提取回收率考察结果

2.1.5 稳定性 计算置于自动进样室8 h内、-20 ℃冻融循环3次、-20 ℃放置7 d 3种不同条件下大鼠血浆中的尼莫地平浓度与标示浓度的比值。结果显示，在上述条件下各浓度质控样品的浓度与标示浓度的偏差均在±15%范围内，表明尼莫地平血浆样品在上述3种条件下稳定性良好（表3）。

表3 尼莫地平血浆样品稳定性考察结果（）

表3 尼莫地平血浆样品稳定性考察结果（）

浓度∕（mg·L-1）100 500 3 000进样室8 h内93.49 ± 1.02 92.12 ± 1.45 86.88 ± 2.87冻融循环85.14 ± 1.50 86.53 ± 5.52 87.89 ± 3.07冻7 d 92.16 ± 1.67 90.78 ± 3.26 87.19 ± 4.32

2.2 药动学结果

药动学结果如图3和表4所示，与对照组相比，联合用药组大鼠AUC（0-24）、Cmax显著升高（P＜ 0.01、P＜ 0.05），Tmax、Vz∕F显著降低（P＜ 0.01、P＜ 0.05），AUC（0-∞）略有升高，MRT（0-24）、MRT（0-∞）、CLz∕F、t1∕2z略有降低，但AUC（0-∞）、MRT（0-24）、MRT（0-∞）、t1∕2z和CLz∕F的变化无统计学意义。

表4 大鼠灌胃尼莫地平后的主要药动学参数

图3 大鼠体内尼莫地平血药浓度-时间曲线

3 讨 论

3.1 血浆样品处理方法的选择

生物样品常用的预处理方法有：（1）直接沉淀法：该法操作简单、快速，是血浆样品预处理最常用的方法，常用的沉淀剂为甲醇和乙腈［11］；（2）固相萃取法：该法可同时完成样品富集与净化，可大大提高检测灵敏度，但固相萃取小柱成本较高；（3）化学衍生化法：该法能够提高检测的灵敏度，但衍生化试剂较贵且操作较为繁琐。

直接沉淀法具有操作简单、快速的优点，因此本实验采用直接沉淀法对血浆样品预处理。因尼莫地平不溶于水，易溶于甲醇、乙腈，所以分别考察了甲醇、乙腈的提取回收率。结果显示，用甲醇、乙腈作沉淀剂时的提取回收率分别为84.4%、79.2%，因此选择甲醇作为本实验的沉淀剂。但在实际样品含量测定过程中无法准确测定血浆样品中尼莫地平的含量，分析原因为使用直接沉淀法对血浆样品进行处理会稀释血浆中尼莫地平的浓度。因此为提高方法灵敏度，用甲醇将蛋白沉淀后，将上清液使用氮气吹干浓缩，再使用溶剂复溶。

复溶溶剂对峰形美观程度具有一定影响。在尼莫地平药动学相关研究中，一般采用流动相作为复溶溶剂，如甲醇∶4 mmol·L-1醋酸铵水溶液（含0.4%甲酸） = 80∶20［9］、乙腈∶水 = 43∶57［10］、甲醇∶水 = 71∶29［11］等，也有研究采用甲醇作为复溶溶剂［12］。Wang等［13］研究了用甲醇作为沉淀剂沉淀后用不同比例的甲醇-水溶液的复溶效果，结果发现，使用30%甲醇作为复溶溶剂效果最好。因此，本实验考察了纯甲醇、流动相（乙腈∶0.1%甲酸水溶液 = 60∶40）、30%甲醇作为复溶溶剂时尼莫地平的峰形。结果显示，纯甲醇作为复溶溶剂时的尼莫地平的峰形优于流动相和30%甲醇作为复溶溶剂时的峰形，而且以纯甲醇作为复溶溶剂时的提取回收率最高，因此选择纯甲醇作为本实验的复溶溶剂。

3.2 药动学

药动学研究结果显示，与对照组相比，联合用药组AUC（0-24）、Tmax、Vz/F、Cmax等药动学参数均有所改变，表明奥拉西坦影响了尼莫地平在大鼠体内的药动学。与对照组相比，联合用药组Vz∕F显著增加（P ＜0.01），Vz∕F代表药物在体内达到动态平衡后体内药量与血药浓度比值，在体内药量相同的情况下，Vz∕F减小表明血药浓度增大，这与联合用药组Cmax显著增大（P ＜0.01）的结果一致。与对照组相比，联合用药组AUC（0-24）显著增加（P＜ 0.05），表明尼莫地平与奥拉西坦联合使用后，尼莫地平在大鼠体内生物利用度有所增加。P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）是一种外排蛋白，它可以将细胞内药物排到细胞外，使细胞内的药物浓度降低，如肠上皮细胞膜上的P-gp可将肠上皮细胞内的药物排出到肠腔，导致药物的吸收减少，生物利用度降低［14］。研究表明，尼莫地平是外排转运蛋白P-糖蛋白（P-gp）和细胞色素P450酶（CYP3A4）的底物，P-gp抑制剂可通过抑制脑中尼莫地平的消除来提高大鼠脑中的浓度，表明P-gp抑制剂对尼莫地平药动学具有一定影响［14-16］。但目前尚未有文献报道有关奥拉西坦对P-gp的调控作用，因此奥拉西坦促进尼莫地平在大鼠体内的吸收、提高生物利用度的机制有待进一步研究。MRT代表药物分子在体内驻留时间的平均值，联合用药组较对照组的MRT（0-24）、MRT（0-∞）、t1∕2z有所缩短，表明奥拉西坦可加速尼莫地平在大鼠体内的代谢，缩短其在体内作用时间。尼莫地平在体内的代谢主要与CYP3A4有关，但目前只有奥拉西坦对经肝微粒体酶CYP2C9代谢的药物的相关研究［17］，尚未有文献报道有关奥拉西坦对CYP3A4代谢酶影响的研究，因此奥拉西坦加速尼莫地平在大鼠体内代谢的机制有待进一步研究。

本实验以大鼠为实验对象，研究了奥拉西坦对尼莫地平药动学的影响。药动学结果提示，奥拉西坦对尼莫地平在大鼠体内药动学产生了影响，奥拉西坦可加快尼莫地平的吸收速度、增加尼莫地平的生物利用度，在一定程度上加快了尼莫地平在大鼠体内的代谢。但人与大鼠间药物吸收代谢机制有所不同，存在种属差异，因此奥拉西坦对尼莫地平在人体内的药动学影响有待进一步研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突