4种枸橼类柑橘果皮挥发性成分分析

钟文彬 岳建强 张碧蓉 闫素云 段敏仙 史文斌 罗心平 周先艳

DOI：10.13925/j.cnki.gsxb.20230446

摘    要：【目的】系統比较4种枸橼类柑橘果皮挥发性成分并筛选差异特征挥发性成分，对利用枸橼类柑橘种质资源及促进柑橘精油产业开发具有重要意义。【方法】采用溶剂萃取结合气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术对云柠1号柠檬、红柠檬、香水柠檬和香橼果皮的挥发性成分进行测定。【结果】在云柠1号柠檬、红柠檬、香水柠檬和香橼果皮中共检测出85种挥发性成分，依次检测出72种、57种、58种、58种；从总挥发性成分含量看，云柠1号柠檬＞香水柠檬＞红柠檬＞香橼。通过偏最小二乘法判别分析（PLS-DA），可将4种枸橼类柑橘品种有效区分；以VIP≥1，p＜0.05为基准，筛选得到12种差异特征挥发性成分，其中云柠1号柠檬果皮中γ-松油烯、β-桧烯、柠檬醛、β-蒎烯、α-蒎烯、橙花醛的含量显著积累；红柠檬果皮中（Z）-α-佛手柑油烯、α-金合欢烯的含量显著积累，其中α-金合欢烯是红柠檬果皮中所特有的；香水柠檬果皮中D-柠檬烯、香茅醛含量显著积累；香橼果皮中香叶醇、紫苏醛含量显著积累。【结论】不同枸橼类柑橘果皮的挥发性成分种类和含量差异显著，其中D-柠檬烯、γ-松油烯、β-桧烯、香茅醛、柠檬醛、香叶醇、（Z）-α-佛手柑油烯、β-蒎烯、α-蒎烯、α-合金欢烯、紫苏醛、橙花醛可作为这4种枸橼类柑橘果皮的差异特征挥发性成分。云柠1号柠檬和香水柠檬香气成分丰富，可作为优异的柑橘香气资源。

关键词：枸橼；果皮；GC-MS；挥发性成分；分析

中图分类号：S666 文献标志码：A 文章编号：1009-9980（2024）02-0266-16

Analysis of volatile substances in peels of four citron varieties

ZHONG Wenbin1， YUE Jianqiang2， ZHANG Birong2， YAN Suyun2， DUAN Minxian2， SHI Wenbin2， LUO Xinping2*， ZHOU Xianyan2*

（1Institute of Plant Resources， Yunnan University， Kunming 650000， Yunnan， China; 2Institute of Tropical and Subtropical Cash Crops， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Baoshan 678000， Yunnan， China）

Abstract： 【Objective】 Systematic comparative analysis of the volatile components in the peel of four main cultivated citron， screening of the characteristic volatile components in the four citrons and analyzing their differences in aroma substances from the perspective of metabolism are of great significance for better utilization of the germplasm resource of citron citrus and promoting the development of citrus essential oil industry. 【Methods】 The volatile components of YN 1 lemon， Red lemon， Xiangshui lemon and Citron peels were detected by low temperature ultrasonic solvent extraction combined with GC-MS， and compounds were identified with the Xcalibur software and NIST mass spectrometry database for compound matching， combined with artificial spectrum analysis and comparison with relevant literature. The content of volatile components was determined by the internal standard method， and the data were statistically analyzed by WPS Office 2020 software. SPSS 26.0 software was used to analyze the variance and difference significance of means. Origin 2021 software was used for constructing graphs with the data， and Simca14.1 for multivariate statistical analysis to screen the characteristic volatile components. Partial least square discriminant analysis （PLS-DA） was used to predict the stability and reliability of the data. 【Results】 There were significant differences in the types and contents of volatile components in the peel of the four citrons. A total of 85 volatile components were detected in the peels of YN 1 lemon， Red lemon， Xiangshui lemon and Citron， and 72， 57， 58 and 58 were detected respectively， which fell into 11 classes， including monothenes， sesquiterpenes， monoterpene alcohols， sesquiterpene alcohols， monothene aldehydes， aldehydes， esters， alcohols， etc. Monothene substances accumulated significantly， accounting for more than 80% of the total volatile components， among which D-limonene was the highest volatile substance in the peels of the four citrons. Among the 85 volatile components detected， 34 were common to the four varieties and they were the typical volatile components of citrons. The peel of YN 1 lemon contained 9 unique volatile components， and the peel of Red lemon contained 7 unique volatile components， while no unique volatile components were detected in the peels of Xiangshui lemon and Citron. YN 1 lemon peel had the highest total volatile component content （24 554.42 ?g·g^-1）， followed by Xiangshui lemon peel with 22 004.48 ?g·g^-1， Red lemon peel with 9 677.24 ?g·g^-1， and Citron peel with the lowest content （6 671.86 ?g·g^-1）. Further， by partial least square discriminant analysis （PLS-DA）， the established PLS-DA model could effectively distinguish the volatile components of the four citron varieties. The largest contribution to principal component 1 （PC1） was D-limonene， followed by citronellal， citral， neral， etc.， and the largest contribution to principal component 2 （PC2） was β-pinene， followed by γ-perpinene， α-pinene， β-myrcene， etc. With VIP≥1， p＜0.05 as the basis， 12 volatile components with different characteristics were screened. Among them， D-limonene， γ-terpinene， β-pinene， citral， β-myrcene， α-pinene and neral were significantly accumulated in the peel of YN 1 lemon. （Z）-α-bergamotene and α-farnesene accumulated significantly in the peel of Red lemon， in which （Z）-α-bergamotene was 61.14 times that of YN 1 lemon， 5.11 times that of Xiangshui lemon and 281.27 times that of Citron， and α-farnesene was unique to the peel of Red lemon. D-limonene and citronellal accumulated significantly in the peel of Xiangshui lemon， especially citronellal， which was 111.77 times that of YN 1 lemon， 37.35 times that of Red lemon and 814.44 times that of Citron. Geraniol and perillal accumulated significantly in Citron peel， in which geraniol was 10.57 times that of YN 1 lemon， 6.17 times that of Xiangshui lemon， and perillal was 3.66 times that of YN 1 lemon， and 16.01 times that of Xiangshui lemon. The contents of D-limonene， citral and neral in the peel of YN 1 lemon and Xiangshui lemon were significantly higher than those of Red lemon and Citron. 【Conclusion】There were significant differences in the types and contents of volatile components in different citron citrus peel. Monopetene compounds were the most important volatile components in the peel of the four kinds of citron varieties. The content and types of volatile components in the peel of YN 1 lemon were the highest， and the content and types of volatile components in the peel of citron were the least. Based on the PLS-DA result， γ-terpinene， β-pinene， α-pinene and β-myrcene might be the characteristic volatile components of YN 1 lemon peel; （Z）-α-bergamotene and α-farnesene were characteristic volatile components of Red lemon peel; citronellal might be used as the characteristic volatile component of Xiangshui lemon peel， and geraniol and perillal might be used as the distinctive volatile components of Citron peel. YN 1 lemon and Xiangshui lemon had rich aroma components and might be excellent citrus aroma resources.

Key words： Citron; Pericarp; The gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）; Volatile components; Analyze

枸橼类（citron-like）是芸香科（Rutaceae）柑橘属（Citrus）植物中的一类，与柚类（cephalocitrus）、蜜柑类（acrumen）和橘亚类（microacrumen）并列为柑橘重要的栽培类型^[1-2]。枸橼（C. medica L.）又名香橼，1753年林奈把枸橼命名为（C. medica L.）、与柠檬（C. limon Burm.）、黎檬（C. limonia Osbeck.）、梾檬（C. qurantifolia Swingle.）以及佛手（C. medica ‘Fingered）共同构成枸橼类（citron-like），主要分布在印度东北部、我国西藏东南部、云南西部、西南部。枸橼类柑橘原发中心位于云南的西部和西南部，在我国长江以南的热带亚热带气候类型的地区均有栽培^[3-4]。枸橼类柑橘果实含有丰富的酚类、黄酮类、生物碱类、香豆素类、维生素类等多种功效性成分，具有理气、舒郁、消痰、利膈等药用和食用价值^[5]。气味物质是人们通过嗅觉可以感觉到的挥发性成分，其果皮挥发性成分对果实香气有决定作用，是果实最重要的风味指标之一^[6]，不同柑橘果实具有独特气味^[7]。

笔者课题组前期已在云南129份枸橼和柠檬种质资源果皮中鉴定到49种挥发性成分，在西藏的50份枸橼果皮中可鉴定到52种成分，D-柠檬烯含量占总挥发性物质含量50%以上，主要包括单萜、单萜醇、单萜醛、单萜酯、倍半萜、倍半萜醇、醛、酮等物质，其中单萜的含量最高^[8]。不同种植区和不同种质资源的柑橘果实挥发性成分存在差异。涂勋良等^[9]对8个不同柠檬品种果皮香气成分进行检测分析，发现8个柠檬品种所含成分种类和相对含量存在品种间差异；张海朋等^[10]分析了7种柑橘108份材料果皮和汁囊的挥发性特征，β-蒎烯和桧烯在5个柠檬种质中的4个中特异积累。此外，不同提取方法、植株不同组织部位及果实不同成熟度的香气成分也存在较大差异。庄晓伟等^[11]通过顶空固相微萃取（HS-SPME）、水蒸气蒸馏法（SD）与气质联用仪（GC-MS）在香橼果皮中分别检测出68种、56种香气成分，发现不同提取方法对挥发性成分检测结果产生一定的影响^[12-14]。冼伟光等^[15]对香橼叶片和果皮挥发性成分进行研究，尤桂春等^[16]對8种柠檬花精油挥发性成分进行研究，揭示了不同部位的挥发性成分情况及差异性。李春秀等^[17]对不同成熟期泰国柠檬和香水柠檬果皮挥发性成分进行研究，发现不同成熟期的香水柠檬和泰国柠檬果实挥发性成分存在较大差异。

而枸橼类柑橘是云南主要栽培或特色的地方柑橘品种，是云南巩固脱贫攻坚成果同乡村振兴有效衔接的主要产业之一。云南的枸橼类柑橘由于特殊的香气越来越受到消费者的喜爱，尤其香水柠檬等广泛应用于新兴的茶饮行业。但关于不同的枸橼类柑橘果实果皮挥发性成分的研究还未见系统的报道。因此笔者在本研究中以4种枸橼类柑橘果实为材料，采用溶剂超声萃取结合GC-MS技术检测云柠1号柠檬、红柠檬、香水柠檬及香橼果皮的挥发性成分，系统比较4种主要栽培的枸橼类柑橘果皮挥发性成分并筛选差异特征性挥发成分，从代谢角度解释4种枸橼类柑橘果实香气差异的原因，对更好地利用枸橼类柑橘种质资源及柑橘精油产业开发具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 材料

云柠1号柠檬、红柠檬、香水柠檬、香橼果实材料均来源于云南柠檬综合试验站柑橘种质资源圃，其中云柠1号柠檬是从尤力克柠檬芽变中选育的品种，广泛种植于云南产区。于2023年1月18日17：00，采集资源圃中处于商品上市期的4种枸橼类果实样品（图1），每个品种选择树龄相同、长势一致的成年健康挂果树3株，每株分别从东南西北中5个方向随机采摘成熟度相同、大小均匀、无病虫害的果实3个，每株树共15个果，作为1次重复，随后带回实验室洗净擦干，削取每个样果赤道面黄皮层一圈，立即置于液氮下充分冻干、混匀，封袋标记，置于-80 ℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 样品处理及萃取（参考周先艳^[8]的方法略有修改） （1）样品前处理：将制备好的样品从-80 ℃低温冰箱取出，取适量样品液氮下充分研磨，称取0.30 g置于2 mL 离心管中，做好标记。

（2）萃取：往装好样品的离心管内添加500 ?L纯水，500 μL含壬酸甲酯（methyl nonanoate，98%，Sigma-Aldrich）87.50 ?g·mL^-1的MTBE液（甲基叔丁基醚methyl tert-butyl ether，≥99.8%，色谱纯，Sigma-Aldrich），盖好混匀后置于4 ℃低温下超声萃取1 h后取出，12 000 r·min^-1离心12 min，小心吸取上清液，过滤膜后置于进样瓶中，使用Thermo TRACE 1600-ISQ 7610GC-MS联用仪（购买于美国赛默飞世尔科技有限公司）测定。

1.2.2 GC-MS条件 色谱柱：TC-5MS石英毛细柱（30 m×0.32 mm，0.25 ?m）；载气：高纯氦气（纯度＞99.999%），恒流模式，流量2 mL·min^-1；进样口温度250 ℃；进样量1 ?L，分流模式，分流比50∶1；升温程序：初始温度40 ℃保持3 min，以2 ℃·min^-1升至160 ℃，保持1 min，以5 ℃·min^-1升至200 ℃，保持1 min，以8 ℃·min^-1升至240 ℃，保持3 min。MS传输线温度280 ℃；离子源温度260 ℃；EI（电子轰击）为离子源，电子轰击能量70 eV；Scan正离子全扫描模式，扫描开始时间为进样后3 min，扫描质量范围45～400 amu。

1.2.3 定性定量分析 定性方法为挥发性物质经气相色谱分离，形成由各成分色谱峰组成的总离子流色谱图，通过Xcalibur软件处理及NIST质谱数据库的化合物匹配，结合人工图谱解析及相关文献进行比对，确定挥发性成分。

定量方法：采用内标法^[18]进行定量，以壬酸甲酯作为内标。计算公式如下：

其中C_i表示样品中该挥发性成分的质量分数（?g·g^-1），A_i表示该挥发性成分在质谱图上的峰面积，A_is表示内标物（壬酸甲酯）在质谱图上的峰面积，C_is表示内标物（壬酸甲酯）的质量浓度（87.50 ?g·mL^-1），M_i表示称取样品质量（g），V表示加入MTBE液的体积（mL）。

1.2.4 数据处理及分析 利用WPS Office 2020软件对试验数据进行统计分析整理；采用SPSS 26.0数据分析软件进行方差、差异显著性分析；利用Origin 2021软件对试验数据进行作图；利用Simca14.1进行PLS-DA多元统计分析。

2 结果与分析

2.1 4种枸橼类柑橘果皮挥发性成分GC-MS总离子流图

4种枸橼类柑橘果皮挥发性成分经过提取、GC-MS测定，得到GC-MS总离子流图谱，如图2所示。从图上可以看出，香橼和红柠檬的峰相对较少，检测出的物质较少，同一出峰时间点峰面积较小，同一成分的含量较低，说明这4种枸橼类柑橘果皮挥发性成分的种类以及含量存在较大差异。

2.2 4种枸橼类柑橘果皮挥发性成分种类与总含量分析

从云柠1号柠檬、红柠檬、香水柠檬、香橼果皮中共检出85种挥发性成分（表1），其中依次检出72、57、58、58种，可分为单萜烯、倍半萜烯、单萜烯醇、倍半萜烯醇、单萜烯醛、醛类、酯类、酮类等共十一大类。根据这85种挥发性成分作upset图（图3），发现4种枸橼柑橘果皮中含有共有挥发性成分34种，是枸橼类柑橘果皮典型挥发性成分；云柠1号柠檬果皮中含有9种特有挥发性成分，分别为三环烯、α-檀香烯、对薄荷^-1（7），8（10）-二烯-9-醇、白菖醇、庚醛、异胡薄荷酯、异丁酸芳樟酯、樟脑、胡椒酮，其含量（w，后同）累计为21.01 ?g·g^-1，占总挥发性成分的0.086%，所占比例非常低；红柠檬果皮中含有7种特有挥发性成分，分别为α-毕澄茄烯、β-毕澄茄烯、α-金合欢烯、δ-杜松烯、己醛、5-乙基-2（5H）-呋喃酮、5，8-二乙基十二烷，其含量累計为52.74 ?g·g^-1，占总挥发性成分的0.54%；而在香水柠檬和香橼两种枸橼类柑橘果皮中并未检测到特有挥发性成分。

在果皮挥发性成分的总含量方面，云柠1号柠檬果皮检出挥发性成分总含量最高，为24 554.42 ?g·g^-1；香橼果皮中总含量最低，为6 671.86 ?g·g^-1；红柠檬果皮中为9 677.24 ?g·g^-1、香水柠檬果皮中为22 004.48 ?g·g^-1。4种枸橼类柑橘品种间差异显著（p＜0.05），变异系数为56.39%，云柠1号柠檬含量最高，其次为香水柠檬，香橼的含量最低。

2.3 4种枸橼类柑橘果皮挥发性成分含量分析

通过对在4种枸橼类柑橘果皮检出的85种挥发性成分进行分类统计，可分为11类（表1），其类别数量及相对含量如图4和图5所示。

2.3.1 单萜烯类 单萜烯类是这4种枸橼类柑橘果皮中最主要的挥发性成分。在云柠1号柠檬果皮中检测出15种；在红柠檬、香水柠檬、香橼果皮中检测出13种。其中4个品种共有挥发性成分12种，分别为α-侧柏烯、α-蒎烯、莰烯、桧烯、β-月桂烯、α-松油烯、D-柠檬烯、（E）-β-罗勒烯、罗勒烯、γ-松油烯、异松油烯、波斯菊萜；三环烯只在云柠1号柠檬中检测到；红柠檬、香水柠檬、香橼果皮中未检测出特有成分。4种枸橼类柑橘果皮中单萜烯类中最主要的成分都是D-柠檬烯，都占总挥发性成分含量的50%以上。从含量方面看，云柠1号柠檬果皮中单萜烯含量最高，为22 742.09 ?g·g^-1，其次是香水柠檬果皮中为18 013.41 ?g·g^-1，红柠檬果皮中为9 171.61 ?g·g^-1，最少是香橼果皮中为6 304.05 ?g·g^-1。从占总挥发性成分含量的比例上看，红柠檬（94.78%）＞香橼（94.49%）＞云柠1号柠檬（92.62%）＞香水柠檬（81.86%），品种间变异系数为54.34%，品种间差异显著（p＜0.05）。

2.3.2 倍半萜烯类 在云柠1号柠檬果皮中检测出13种倍半萜烯类挥发性成分；在红柠檬、香水柠檬、香橼果皮中均检测出16种。其中4个品种共有挥发性成分有9种，为石竹烯、（Z）-α-佛手柑油烯、葫芦烯、β-檀香烯、（Z）-β-金合欢烯、（E）-β-金合欢烯、γ-榄香烯、α-雪松烯、β-红没药烯；α-檀香烯仅在云柠1号柠檬果皮中检测到；α-毕澄茄烯、β-毕澄茄烯、α-金合欢烯、δ-杜松烯仅在红柠檬果皮中检测到；香橼、香水柠檬果皮中并未检测出特有挥发性成分。从含量方面看，倍半萜烯类在香水柠檬果皮中的含量最高，为637.83 ?g·g^-1，是其第三大类别成分；其次是在云柠1号柠檬果皮中为462.24 ?g·g^-1，是其第三大类别成分；红柠檬果皮中为226.19 ?g·g^-1，是其第二大类别成分；最低的是香橼果皮中为71.67 ?g·g^-1，是其第四大类别成分。从占总挥发性成分含量的比例上看，香水柠檬（2.90%）＞红柠檬（2.33%）＞云柠1号柠檬（1.88%）＞香橼（1.07%）。变异系数为71.68%，品种间差异显著（p＜0.05）。

2.3.3 单萜烯醇类 在云柠1号柠檬、红柠檬、香水柠檬、香橼果皮中依次检测出13、8、9、11种单萜烯醇类挥发性成分。其中4个品种共有成分有4种，为（Z）-β-松油醇、芳樟醇、α-松油醇、（E）-驱蛔脑二醇；对薄荷-1（7），8（10）-二烯-9-醇仅在云柠1号柠檬果皮中检测到；红柠檬、香橼、香水柠檬果皮中未检测出特有挥发性成分。从含量方面看，单萜烯醇类在云柠1号柠檬果皮中含量最多，为225.46 ?g·g^-1，是其第四大类别成分；其次是香水柠檬果皮中为141.53 ?g·g^-1，是其第四大类别成分；香橼果皮中为130.17 ?g·g^-1，是其第三大类别成分；最少是红柠檬果皮中为84.74 ?g·g^-1，是其第三大类别成分。从占总挥发性成分含量的比例上看，香橼（1.95%）＞云柠1号柠檬（0.92%）＞红柠檬（0.88%）＞香水柠檬（0.64%）。变异系数为40.35%，品种间差异显著（p＜0.05）。

2.3.4 倍半萜烯醇类 4种枸橼类柑橘果皮中含倍半萜烯醇较少，占挥发性成分总量的0.03%～0.11%。在云柠1号柠檬、红柠檬、香水柠檬、香橼果皮中依次检测出6、2、4、3种倍半萜烯醇类。其中4个品种共有成分1种，为异长叶醇；白菖醇只在云柠1号柠檬果皮中检测到；红柠檬、香橼、香水柠檬果皮中并未检出特有挥发性成分。从含量方面看，倍半萜烯醇类在香水柠檬果皮中含量最高，为24.04 ?g·g^-1；其次是云柠1号柠檬果皮中为22.58 ?g·g^-1；红柠檬果皮中为3.72 ?g·g^-1；最低是香橼果皮中为1.96 ?g·g^-1。从占总挥发性成分含量的比例上看，香水柠檬（0.11%）＞云柠1号柠檬（0.09%）＞红柠檬（0.04%）＞香橼（0.03%）。变异系数为90.68%，品种间差异显著（p＜0.05）。

2.3.5 单萜烯醛类 单萜烯醛类在这4种枸橼类柑橘果皮中含量较多，占挥发性成分总量的0.74%～13.87%。在云柠1号柠檬、红柠檬、香水柠檬、香橼果皮中依次检测出4、3、4、3种单萜烯醛类。其中4个品种共有成分2种，为香茅醛和柠檬醛；云柠1号柠檬、红柠檬、香橼、香水柠檬果皮并未检出特有挥发性成分。从含量方面看，单萜烯醛类在香水柠檬果皮中含量最高，为3 051.16 ?g·g^-1，占总挥发性成分含量的13.87%，是香水柠檬区别于其他3个品种的主要挥发性成分，是其第二大类别成分；其次是云柠1号柠檬果皮中为834.79 ?g·g^-1，占总挥发性成分含量的3.40%，是其第二大类别成分；香橼果皮中为133.78 ?g·g^-1，占总挥发性成分含量的2.01%，是其第二大类别成分；最低是红柠檬果皮中为71.66 ?g·g^-1，占总挥发性成分含量的0.74%，是其第五大类别成分；其中香茅醛在香水柠檬果皮中含量特异性累积，高达2 466.85 ?g·g^-1，占香水柠檬果皮总挥发性成分含量的11.21%，属于第二大挥发性成分，远超于云柠1号柠檬、红柠檬、香橼果皮中的含量，是云柠1号柠檬的111.77倍、红柠檬的37.35倍、香橼的814.44倍。变异系数为136.46%，品种间差异显著（p＜0.05）。

2.3.6 醛类 4种枸橼类柑橘果皮挥发性成分中含醛类物质较少，占挥发性成分总量的0.06%～0.78%。在云柠1号柠檬、红柠檬、香水柠檬、香橼果皮中依次检测出8、7、4、4种醛类。其中4个品种共有挥发性成分3种，为壬醛、葵醛、十一醛；庚醛只在云柠1号柠檬果皮中检测到；己醛只在红柠檬果皮中检测到；香橼、香水柠檬果皮中并未检测出特有挥发性成分。从含量方面看，醛类在红柠檬果皮中含量最高，为75.39 ?g·g^-1，占总挥发性成分含量的0.78%；其次是在香水柠檬果皮中为69.64 ?g·g^-1，占总挥发性成分含量的0.32%；在云柠1号柠檬果皮中为60.38 ?g·g^-1，占总挥发性成分的0.25%；最低是在香橼果皮中为3.69 ?g·g^-1，占总挥发性成分含量的0.06%。变异系数为60.08%，品种间差异显著（p＜0.05）。

2.3.7 酸类 香叶酸是唯一检测出来的挥发性有机酸，仅在香水柠檬、香橼果皮中检出，含量微少。在香水柠檬果皮中为0.76 ?g·g^-1，占总挥发性成分含量的0.003 5%；在香橼果皮中为2.40 ?g·g^-1，占总挥发性成分含量的0.036%。变异系数为143.44%，品种间差异显著（p＜0.05）。

2.3.8 酚类 麝香草酚是唯一检测出来的挥发性有机酚，只在云柠1号柠檬、香橼果皮中检出，含量微少。在云檸1号柠檬果皮中为0.84 ?g·g^-1，占总挥发性成分含量的0.003 4%；在香橼果皮中为0.77 ?g·g^-1，占总挥发性成分含量的0.012%。变异系数为115.71%，品种间差异显著（p＜0.05）。

2.3.9 酯类 4种枸橼类柑橘果皮挥发性成分中含酯类较少，占挥发性成分总量的0.09%～0.71%。在云柠1号柠檬、红柠檬、香水柠檬、香橼果皮中依次检测出6、2、4、3种酯类。其中4个品种共有成分1种，为2-甲基辛酸甲酯；异胡薄荷酯、异丁酸芳樟酯只在云柠1号柠檬果皮中检出；红柠檬、香橼、香水柠檬果皮中未检出特有挥发性成分。从含量方面看，酯类在云柠1号柠檬果皮中含量最高，为174.91 ?g·g^-1，占总挥发性成分含量的0.71%；其次在香水柠檬果皮中为53.50 ?g·g^-1，占总挥发性成分含量的0.24%；在香橼果皮中为16.10 ?g·g^-1，占总挥发性成分含量的0.24%；最低是在红柠檬果皮中为8.49 ?g·g^-1，占总挥发性成分含量的0.09%。变异系数为121.73%，品种间差异显著（p＜0.05）。

2.3.10 酮类 4种枸橼类柑橘果皮挥发性成分中含酮类较少，占挥发性成分总量的0.01%～0.06%。在云柠1号柠檬果皮中检测出樟脑、胡椒酮、7-甲氧基香豆素3种，含量为8.99 ?g·g^-1；在红柠檬果皮中检测出5-乙基-2（5H）-呋喃酮和7-甲氧基香豆素2种，含量为5.70 ?g·g^-1；在香水柠檬、香橼果皮中只检测出7-甲氧基香豆素1种，含量分别为5.20 ?g·g^-1、0.86 ?g·g^-1。变异系数为64.34%，品种间差异显著（p＜0.05）。

2.3.11 其他 4种枸橼类柑橘果皮中还检测到其他的挥发性物质，占总量的0.03%～0.31%。在云柠1号柠檬果皮中检出邻-伞花烃、6-甲基十八烷、2-甲基十九烷3种，含量为22.14 ?g·g^-1；在红柠檬果皮中检出邻-伞花烃、5，8-二乙基十二烷、6-甲基十八烷、2-甲基十九烷4种，含量为29.75 ?g·g^-1；在香水柠檬果皮中检出邻-伞花烃、6-甲基十八烷2种，含量为7.41 ?g·g^-1；在香橼果皮中只检出6-甲基十八烷、2-甲基十九烷2种，含量为6.40 ?g·g^-1。变异系数为69.59%，品种间差异显著（p＜0.05）。

2.4 4种枸橼类柑橘果皮挥发性成分含量的差异分析

以检出的85种挥发性成分含量作为因变量参数，4种枸橼类柑橘品种作为自变量，通过SIMCA.14.1作偏最小二乘法判别分析（PLS-DA，图6）。本次分析中自变量拟合指数（Rx2）为1，因变量拟合指数（Ry2）为0.999，模型预测指数（Q2）为0.999。Rx2、Ry2、Q2均大于0.9，表明该模型对自变量X及因变量Y均具有较好的解释能力，也表明该模型具有较强的预测能力，该模型拟合结果可接受^[19]。经过200次置换检验，如图6-A所示，Q2回归线与纵轴的相交点小于0，说明模型不存在过拟合，模型验证有效，认为该结果可用于这4种枸橼类的鉴别分析。

所建立模型中主成分1（PC1）的方差贡献率为69.1%，主成分2（PC2）的方差贡献率为28.4%，累计方差贡献率为97.50%，其能够代表数据整体。以第一主成分和第二主成分为横纵坐标建立样品和挥发性化合物的相关性得分图和载荷图（图6-B～C），发现样品的相似度在95%的置信区间内，各样品表现出明显的聚类趋势，未发现离群样本点，说明建立的PLS-DA模型可对4个品种进行分类。由图6-B可以看出，4个枸橼类柑橘品种的得分图散点在不同的象限，同一个品种的主成分得分散点重复性良好。在PC1上，4个枸橼类柑橘品种可以明显区分；在PC2上，云柠1号柠檬、红柠檬、香水柠檬和香橼具有一定的区分度，香水柠檬和香橼不能完全进行区分。说明4种枸橼类柑橘果皮挥发性成分存在一定区别，可以实现4个枸橼类柑橘品种样品的有效区分。主成分中某一组分的载荷值越高，说明该组分对该主成分所起作用越大。由图6-C可以看出，对PC1贡献最大的是D-柠檬烯，依次是香茅醛、柠檬醛、橙花醛等，可以认为PC1代表的是D-柠檬烯、香茅醛、柠檬醛、橙花醛等为组合的挥发性成分；对PC2贡献最大的是桧烯，依次是γ-松油烯、α-蒎烯、β-蒎烯等，因此PC2代表了以桧烯、γ-松油烯、α-蒎烯、β-蒎烯等为组合的挥发性成分。

通过PLS-DA的变量投影重要度（VIP）分析不同挥发性成分对4种枸橼类柑橘果皮香味的贡献率（表1）。根据p＜0.05且VIP≥1的标准，筛选云柠1号柠檬、红柠檬、香水柠檬、香橼果皮挥发性成分差异特征挥发性成分，共筛选到12种差异特征挥发性成分（表2），分别是D-柠檬烯、γ-松油烯、桧烯、β-蒎烯、α-蒎烯、（Z）-α-佛手柑油烯、α-金合欢烯、香叶醇、香茅醛、柠檬醛、紫苏醛、橙花醛，并根据其含量作热图分析。如图7所示，云柠1号柠檬果皮中D-柠檬烯、γ-松油烯、檜烯、柠檬醛、β-蒎烯、α-蒎烯、橙花醛含量显著积累，而不含α-金合欢烯，表现出强烈的柑橘、柠檬香味；红柠檬果皮中（Z）-α-佛手柑油烯、α-金合欢烯含量显著积累，特含有α-金合欢烯而不含香叶醇、紫苏醛，表现出柑橘清新淡雅、花香、果香；香水柠檬果皮中D-柠檬烯、香茅醛含量显著积累，而不含β-蒎烯、α-金合欢烯，表现出柠檬、香茅气味；香橼果皮中香叶醇、紫苏醛含量显著积累，而不含α-金合欢烯，表现为温和玫瑰、辛香气味。其中D-柠檬烯、柠檬醛、橙花醛在云柠1号柠檬和香水柠檬果皮中含量显著高于红柠檬和香橼；γ-松油烯在云柠1号柠檬和香橼果皮中含量显著高于红柠檬和香水柠檬。上述各品种果皮中的差异特征挥发性成分对构成这4个品种果实独特香味的差异有一定的影响。

3 讨 论

云柠1号柠檬、红柠檬、香水柠檬、香橼果实果皮中依次检出72、57、58、58种挥发性成分。这一结果与笔者课题组前期研究^[8]、王小柯等^[24]、涂勋良等^[9]前人研究结果存在差异，这与所使用的提取和检测方法不同有关。笔者在本研究中也发现4种枸橼类柑橘果皮挥发性成分中单萜烯类都是最主要的成分，占总挥发性成分含量的80%以上，且云柠1号柠檬、红柠檬、香橼果皮中单萜烯类含量占总挥发性物质含量的90%以上，说明单萜烯类物质在枸橼类柑橘果皮中高含量累积，与张海朋等^[7]研究结果一致。云柠1号柠檬、香水柠檬、香橼果皮中单萜醛类含量较高，红柠檬果皮中单萜醛类物质含量较低，说明单萜醛类物质在枸橼类柑橘果皮中特异性积累，与笔者课题组前期研究结果一致^[8]。其中在香水柠檬果皮中单萜烯醛含量较高，占总挥发性成分含量的13.87%，主要是香茅醛、柠檬醛、橙花醛的含量较高，尤其是香茅醛极显著累积，而在其他3种枸橼类柑橘果皮中含量较低，分别是云柠1号柠檬的111.77倍、红柠檬的37.35倍、香橼的814.44倍，因此可选择研究果皮中单萜醛（尤其香茅醛）含量累积情况作为香水柠檬区别于其他3种枸橼类柑橘的主要特异挥发性成分。在4种枸橼类柑橘果皮挥发性组分中D-柠檬烯的含量都是第一大成分，占总挥发性物质含量50%以上，与DI Rauso Simeone等^[25]研究结果一致。

PLS-DA根据给定的样品分组信息，对样品结构数据进行判别分析，常用于区分各组间代谢轮廓的总体差异，筛选组间的差异代谢物。高歌等^[26]通过PLS-DA实现了国内各种类型的柚子品种的香气特征差异分析。目前并未有人系统地比较多种枸橼类柑橘果皮挥发性成分的差异，而笔者在本研究中通过PLS-DA分析将4种枸橼类柑橘种质资源分开，筛选得到12个差异特征挥发性成分。其中D-柠檬烯、γ-松油烯、桧烯、柠檬醛、β-蒎烯、α-蒎烯、橙花醛在云柠1号柠檬果皮中显著积累；（Z）-α-佛手柑油烯、α-金合欢烯在红柠檬果皮中显著积累；D-柠檬烯、香茅醛在香水柠檬果皮中显著积累；香叶醇、紫苏醛在香橼果皮中显著积累。这12个特征挥发性成分对4种枸橼类柑橘果皮挥发性成分的区分具有较大的贡献，这4个品种枸橼类柑橘果皮特异性的显著累积导致其果实独特的风味。

以上结果也与前人研究的结果存在差异，这与检测技术方法^[11-14]、品种遗传差异性^[27-28]、种植环境因素^[29]、管理水平^[30]，砧木种类^[31]、果实成熟度^[22]、采后操作^[23]等因素有关，后续研究将加大样本量、扩大挥发性成分的研究范围，进一步分析枸橼类柑橘果皮中各特征挥发性成分。而4种枸橼类柑橘果实表现出来的不同芳香气味类型，是果皮挥发性成分在种类和含量上的差异，以及某些特有成分、共有成分共同作用的结果，要探明这4种枸橼类柑橘果实独特的香味来源，不但要研究不同挥发性物质在不同含量条件下互配的混合效果，还要结合研究人员对不同挥发性成分的气味阈值进行判断，这有待进一步深入研究。

4 结 论

4种枸橼类柑橘果皮的挥发性成分种类和含量差异显著。在云柠1号柠檬、红柠檬、香水柠檬、香橼果皮中共检出85种挥发性成分，依次检出72、57、58、58种，共有挥发性成分有34种，云柠1号柠檬、红柠檬果皮中含有特有挥发性成分，香水柠檬和香橼果皮中未检出特有挥发性成分。通过PLS-DA分析，可将4种枸橼类柑橘品种有效区分，其中D-柠檬烯、γ-松油烯、桧烯、香茅醛、柠檬醛、香叶醇、（Z）-α-佛手柑油烯、β-蒎烯、α-蒎烯、α-合金欢烯、紫苏醛、橙花醛可以作为这4种枸橼类柑橘果皮的差异特征挥发性成分。云柠1号柠檬和香水柠檬香气成分丰富，可作为优异的柑橘香气资源。

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收稿日期：2023-10-26 接受日期：2023-12-19

基金項目：国家自然科学基金（32060563）；云南省科技厅科技人才与平台计划（202105AD160049）；云南省科技厅重大科技专项（202102AE090054）；德宏州英才兴边计划（2022RC010）

作者简介：钟文彬，男，在读硕士研究生，研究方向为采后生物学与技术。E-mail：2913930878@qq.com

*通信作者 Author for correspondence. E-mail：rjslxp@126.com；E-mail：lyfzhouxianyan@163.com