消退素D1 对结肠癌细胞K-Ras/ Notch 信号通路串话的影响

杜 恒 吴安定 余 洁 王 飞 周 勇

湖北省黄冈市中心医院胃肠外科，湖北黄冈 438000

结肠癌发病机制与多种因素有关，如肿瘤炎症微环境、基因突变等，引发多种信号通路的变化[1]。实际上，信号转导过程并非均是线性传导，信号通路间存在串话现象[2]。研究显示，IL-6 可激活STAT3、Ras 和Notch 等多种信号通路，引发串话现象，进而介导肿瘤发生、发展和侵袭、转移[3]。消退素D1（resolvin D1，RvD1）是一种新型抗炎消退脂质介质，在许多炎症相关疾病模型中可抑制白细胞介素（interleukin，IL）-6分泌[4-5]。有研究显示，RvD1 可减轻炎症微环境抑制肺癌细胞侵袭、转移，但RvD1 对结肠癌细胞的影响尚不明确[5]。本实验基于IL-6 介导的信号途径，探讨RvD1 通过炎症微环境介导Ras 串话Notch 信号通路的影响，及对下游转录因子和上皮细胞-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的作用，为RvD1 在结肠癌的临床治疗实践中提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

结肠癌细胞株SW620（ATCC 公司，HTX1675），Rv D1（Cayman 公司，10012554），K-Ras 质粒（基因生物，G12D）；LipofectamineTM3000（ThermoFisher，L3000008）、IL-6 抗体（上海雅吉公司，0782R）。以下购于Absin公司：K-Ras、NICD、p-p65、p65、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、GAPDH、ELISA 试剂盒（abs115469、abs131403、abs130624、abs131170、abs130068、abs155766、abs171412、abs830030、abs510003）；Cy3 标记山羊抗兔(Abcam 公司，ab6939）；CCK-8 试剂（上海碧云天生物技术股份有限公司，C0037）；吉姆萨染液（上海碧云天生物技术股份有限公司，C0133）；BCA 蛋白质浓度测定试剂盒（Biosharp 公司，BL521A）；Transwell 板（8.0 μm，Corning公司，3428），倒置荧光显微镜（OLYMPUS 公司，Ⅸ73），成像系统（Q-IMAGING 公司，MicroPublisher）。

1.2 细胞培养和分组

SW620 细胞培养于RPMI-1640 培养基（10%的胎牛血清），在37℃、5%CO2培养箱孵育。实验设立空白组、RvD1 组、K-Ras 组、K-Ras+RvD1 组。空白组不处理，K-Ras 组、K-Ras+RvD1 组转染K-Ras 质粒（G12D），RvD1 组和K-Ras+RvD1 组细胞按2×105/孔接种于6 孔板，过夜后加入250nmol/L RvD1，孵育48h。SW620 细胞于6 孔板中转染，按照每孔2 μl∶6 μg 比例混合转染试剂和质粒，48 h 后收获细胞进行后续实验。

1.3 CCK-8 细胞活性实验

SW620 细胞按照每孔2×103接种于96 孔板，每组4 个复孔，过夜后加入0、62.5、125.0、250.0、500.0 nmol/L的RvD1，48 h 后每孔加入10 μl 的CCK-8 试剂，37 ℃孵育2 h，用酶标仪检测450 nm 处OD 值。

1.4 克隆形成实验

SW620 细胞按照每孔800 个细胞接种于6 孔板，每组3 个复孔，过夜后加入待细胞贴壁后0、62.5、125.0、250.0、500.0 nmol/L 的RvD1，每周更换1 次培养液，培养14 d 后，固定，吉姆萨染液染色，拍照，记录每孔克隆数量。

1.5 Western blot 检测

SW620 细胞经PBS 清洗、RIPA 裂解、BCA 蛋白定量后，40 μg 上样蛋白经上样缓冲液稀释、沸水浴5 min，然后经10%SDS-PAGE 胶电泳，再通过湿转法将目的蛋白转移至PVDF 膜；5%BSA 室温封闭l h，加入IL-6、K-Ras、NICD、p-p65、p65、vimentin、N-cadherin、E-cadherin 一抗稀释液（1∶500），4℃的条件下孵育过夜，之后加入二抗稀释液（1∶500），常温孵育30 min，TBST 清洗4 次，ECL 溶液曝光，最后完成显影、定影。用AlphaEaseF 软件分析目标条带OD 值。空白组和RvD1 组之间比较IL-6、K-Ras、NICD 的表达差异，空白组、RvD1 组、K-Ras 组、K-Ras+RvD1 组之间比较NICD、p-p65、p65、vimentin、N-cadherin、E-cadherin的表达差异，每组3 个复孔。

1.6 免疫荧光检测

收集空白组、RvD1 组细胞，每组3 个复孔。经PBS清洗、固定、破膜、去除过氧化氢酶。于湿盒中加入IL-6、K-Ras 和NICD 一抗稀释液（1∶100），4 ℃孵育过夜，PBS 清洗，用Cy3 标记的二抗稀释液（1∶500）常温孵育1 h，PBS 清洗。用100 μl DAPI 染液室温孵育5 min，PBS 清洗后加入抗荧光淬灭剂并封片，显微镜观察荧光表达。

1.7 Transwall 实验

K-Ras 组和K-Ras+RvD1 组细胞被重悬于无血清培养液中，调整为106个/ml。迁移检测时，取100 μl细胞悬液加入Transwell 小室中，600 μl 含10%胎牛血清的培养液加入Transwell 下室，培养48 h 后，取出小室，用棉签轻擦拭去上室细胞，小室清洗、固定、吉姆萨染液染色10 min，于100 倍视野下随机选取5 个视野计数，每组3 个复孔。检测细胞侵袭时，先用50μg/孔Matrigel 包被Transwell 小室，成胶后余操作同细胞迁移方法。

1.8 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，比较采用t 检验。不符合正态分布的计量资料以中位数和四分位数[M（P25，P75）]表示，比较采用Mann-Whitney U 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RvD1 对SW620 细胞存活和增殖的影响

细胞活力和克隆形成数量随RvD1 剂量升高而下降。浓度125.0、250.0、500.0 nmol/L RvD1 的细胞活力低于0 nmol/L组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1A。浓度250、500 nmol/L RvD1 的细胞克隆数量低于0 nmol/L组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1B。浓度250.0、500.0 nmol/L RvD1 的细胞活力和克隆数量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。最终250 nmol/L 处理48 h 作为后续实验条件。

图1 RvD1 对SW620 细胞存活和克隆形成能力的影响

2.2 RvD1 对SW620 细胞中IL-6、K-Ras 和NICD蛋白表达的影响

与空白组比较，RvD1 组IL-6、K-Ras 和NICD 的蛋白水平和细胞内表达水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2 空白组和RvD1 组IL-6、K-Ras 和NICD 蛋白表达水平

2.3 RvD1 对SW620 细胞K-Ras 串 话Notch 信号通路及EMT 的影响

与空白组比较，RvD1 组NICD、p-p65、vimentin和N-cadherin vimentin 水平降低，E-cadherin 水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；K-Ras 组NICD、p-p65、vimentin 和N-cadherin 水平升高，E-cadherin水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；K-Ras+RvD1 组的NICD、p-p65、vimentin 和N-cadherin 水平低于K-Ras 组，E-cadherin 水平高于K-Ras 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

图3 RvD1 对SWB20 细胞IL-6 和Ras、Notch 信号通路的影响

2.4 RvD1 对SW620 细胞侵袭、迁移能力的影响

与空白组比较，RvD1 组和K-Ras 组的细胞迁移和侵袭能力分别降低和升高（P＜0.05）；与K-Ras 组比较，K-Ras+RvD1 组的细胞迁移和侵袭能力降低（P＜0.05）。见图4。

图4 RvD1 对SW620 细胞侵袭和迁移的影响

3 讨论

RvD1 具有强大抗炎作用，可抑制肿瘤坏死因子-α 和IL-6 等炎症因子分泌[6-7]。本研究发现RvD1 剂量依赖抑制SW620 细胞生长，提示RvD1 发挥抗结肠癌作用。IL-6 在多个方面促进了肿瘤恶化，包括诱导肿瘤生长、化疗抵抗、EMT、血管生成和淋巴结转移[8-13]。本研究发现RvD1 降低SW620 细胞的IL-6 水平，并且在降低炎症水平同时，对Ras 和Notch 两个代表性致癌通路均有抑制作用。研究显示，IL-6 通过结合其受体促进多种致癌通路活化，包括Ras/MAPK 和PI3K/Akt 通路。K-Ras 作为Ras 基因家族成员，位于12号染色体，正常情况下处于非活化状态[14-16]。然而，K-Ras 异常活跃会引起细胞大量生长和增殖，诱发癌变[17]。研究显示，部分结肠癌患者K-Ras 点突变可引起RAS 蛋白持续活化[18]。因此，K-Ras 基因属于高频突变的结肠癌致癌通路，并且在临床上对于靶向药物治疗的选择以及治疗效果和预后的评估具有重要意义[19]。

K-Ras 通过参与信号串话，协同Notch 通路进程[20]。Notch 通路是结肠癌最为重要的信号通路之一，具有高度保守性。研究显示，K-Ras 通过激活p38MAPK 通路增加Notch-1 表达[21]。邻近细胞的Notch 跨膜受体与配体相互作用，改变受体构象，随后在γ 分泌酶的作用下，跨膜受体发生水解并释放出NICD，NICD 进一步转移到细胞核内与转录因子结合，调控靶基因的表达[20-21]。本研究结果显示，高表达K-Ras 通过信号串话上调癌细胞中NICD 水平和Notch 信号通路活性，RvD1 则抑制K-Ras 上调NICD 的作用；其机制可能是通过干预K-Ras 与Notch 信号串话，抑制结肠癌细胞的生长，这一发现为RvD1 的抗癌机制提供了新的线索。本研究观察到RvD1 对K-Ras/Notch 信号通路的抑制，削弱了核因子（nuclear factor，NF）-κB 主要活性亚单位NF-κB p65 表达和下游EMT 水平。NF-κB是Notch 通路下游转录表达基因，这是Notch 激活NF-κB 的一种机制[22]。此外，NICD 竞争性结合NF-κB抑制蛋白IκB-α，可能是Notch 激活NF-κB 的另一机制[23]。基于这些发现，推测RvD1 通过抑制K-Ras 并干扰Notch 通路的信号串话，进而影响上述机制，导致磷酸化型NF-κB p65 水平下调。EMT 是肿瘤细胞失去上皮极性特征和细胞-细胞连接，是导致肿瘤扩散、组织浸润和定居的重要原因。NF-κB 作为转录因子，可转录EMT 相关基因，激活并促进EMT 进程[24]。

本研究与最近的研究一致，高陈陈等[25]报道NF-κB参与消退素的炎症消退作用，朱天琦等[5]研究发现RvD1可通过TGF-β 抑制肺癌细胞上皮间质转化。这些结果揭示抑制K-Ras/Notch/NF-κB/EMT 信号串话，可能是RvD1 抑制结肠癌细胞侵袭、转移行为的原因之一。鉴于IL-6 下游靶信号通路众多且易引发串话，RvD1 对信号串话的抑制现象符合信号转导网络改变的特征。

综上所述，RvD1 通过下调IL-6 表达，抑制K-Ras对Notch 信号通路的串话。这一作用进而降低下游NF-κB 活性和EMT，减弱结肠癌细胞增殖和侵袭迁移能力，为结肠癌的临床治疗提供一定的理论依据。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。