转基因小鼠源性胰腺癌原位移植瘤模型的构建与评价

安庆玲，谭邓旭，赵亚，张彩勤，师长宏

（空军军医大学实验动物中心，西安 710032）

胰腺癌是恶性程度最高的肿瘤之一，早诊率低、进展快、预后差，患者5 年生存率仅为12%[1-4]。既往首选手术治疗，但仅20%患者可手术，且术后复发率高[5]。 很多患者对放疗不敏感，化疗易产生耐药，同样收效甚微，这可能与胰腺癌致密的基质环境和独特的免疫浸润有关[6-8]。 这些基质成分不仅阻滞化疗药物的浸润，还能增加肿瘤细胞的活性、塑造免疫抑制微环境，促进肿瘤发生发展[9-12]。建立稳定可靠且能够模拟胰腺癌患者的肿瘤基质与免疫微环境的药物临床前研究动物模型[13-15]，对于研究胰腺癌的发病机制，探索更加有效的治疗方案至关重要。

目前胰腺癌动物模型包括化学诱导模型、移植瘤模型和基因工程模型。 化学诱导模型个体差异大，治疗窗口期较短；移植瘤模型缺乏丰富的基质环境和免疫细胞浸润；基因工程模型能够模拟患者胰腺癌的遗传改变，塑造胰腺癌复杂的基质成分和免疫微环境，是研究胰腺癌发生、进展，筛选治疗策略的理想动物模型[16]。LSL-KrasG12D／＋LSLTrp53R172H／＋Pdx1-Cre（KPC）转基因小鼠是研究胰腺癌最常用的自发转基因小鼠模型，其原癌基因LSLKrasG12D／＋在胰腺上特异性活化，抑癌基因LSLTrp53R172H／＋在胰腺被特异性抑制，从而诱导胰腺癌的发生。 但是，该小鼠模型自发肿瘤周期长，肿瘤异质性高，成瘤时间不稳定，组内肿瘤一致性较差[17-18]。 为了克服KPC 小鼠的缺点，扩大其在胰腺癌药物临床前研究中的应用，尝试将其自发性胰腺癌肿瘤组织块移植到C57BL／6J 小鼠胰尾，完善造模方法和评价技术，从而获得批量、均一且稳定生长的原位模型，以模拟更加贴合临床特征的胰腺癌微环境和稳定的胰腺癌进展过程，促进胰腺癌发病机制、预防措施和治疗方案的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

2 只SPF 级雄性LSL-KrasG12D／＋LSL-Trp53R172H／＋（KP）小鼠、2 只SPF 级雌性Pdx1-Cre小鼠和66 只SPF 级雄性C57BL／6J 小鼠，6 ～8 周龄，18 ～22 g，均购自江苏集萃药康生物科技有限公司【SCXK（苏）2023-0009】，饲养在空军军医大学实验动物中心SPF 级屏障设施内【SYXK（陕）2019-001】。 环境温度23 ～25 ℃，相对湿度40% ～60%，12 h 昼夜交替，小鼠笼盒、垫料、饲料及饮用水等经高温高压灭菌处理，动物自由摄食和饮水。 本动物实验获得空军军医大学实验动物福利及伦理委员会批准（IACUC-20220830）。

1.1.2 主要试剂与仪器

DMEM 培养基、 胎牛血清（Gibco）， DMSO（Sigma，D2650），兔源Ki67 抗体（Abcam，ab16667），鼠源α-SMA 抗体（Servicebio，GB13044），兔源CD45抗体（proteintech，20103-1-AP），鼠源CD206 抗体（proteintech，60143-1-lg），Cy3 标记山羊抗兔IgG（GB21303-100UL）， Cy3 标记山羊抗小鼠 IgG（GB21301-100UL），DAPI（Leagene，DA002），甘油明胶（Solarbio， S2150）。 彩色多普勒超声系统（Mindray，ZS3 SCI），光学显微镜（OLYMPUS，BX43）用于HE 染色拍摄，Image J 1.8.0 软件进行半定量分析，激光扫描共聚焦显微镜（ZEISS，LSM 900）用于免疫荧光染色拍摄和分析。

1.2 方法

1.2.1 原位模型构建以及肿瘤组织的冻存与复苏

将KP 小鼠与Pdx1-Cre小鼠合笼进行交配，新生的小鼠经琼脂糖凝胶电泳鉴定基因筛选得到KPC 小鼠。 选择自发胰腺癌的KPC 小鼠作为移植供体，于状态明显较差、临近仁慈终点的时候进行安乐死，在无菌条件下取出胰腺原发肿瘤，该肿瘤组织为P0 代（Passage 0）。 将P0 代原发胰腺癌组织快速转移至4 ℃的DMEM 培养液中，去除坏死部分，选择质地均匀的肿瘤部分修剪成2 mm × 2 mm× 2 mm 大小一致的组织块，用于后续移植或冻存。将10 只6 ～8 周龄的C57BL／6J 小鼠作为移植受体，用戊巴比妥钠按照30 mg／kg 剂量进行麻醉，左侧腹部剃毛后，采用无菌操作进行手术，用缝合线将胰腺癌组织块缝合到胰尾，术后将小鼠放置37 ℃保温毯上直至苏醒。 将剩余部分P0 代肿瘤组织块置入含有90%胎牛血清与10% DMSO 的1.5 mL 冻存管内，梯度降温后液氮保存。 复苏时，从液氮拿出冻存管迅速置于37 ℃水浴锅中复温，DMEM培养液清洗肿瘤组织去掉残留冻存液后将组织块移植于36 只C57BL／6J 小鼠的胰尾，验证肿瘤复苏成功率。

1.2.2 超声监测

手术完成后，每2 ～3 d 用彩色多普勒超声对肿瘤的生长情况进行监测，于肿瘤体积800 ～1000 mm3结束观察并对其进行安乐死，收集胰腺肿瘤、肠、腹膜、脾、肾、肝和肺置于4%多聚甲醛中性固定液中，石蜡包埋后切片。

1.2.3 HE 染色

石蜡切片二甲苯脱蜡，100%、90%、80%、70%乙醇各5 min 覆水，苏木精染色5 min，乙酸分化2 s，促蓝液返蓝1 min，伊红染色5 min，70% ～95%梯度乙醇脱水各5 min，浸泡二甲苯后用中性树脂封片，显微镜下观察并拍照。

1.2.4 免疫荧光染色

石蜡切片二甲苯脱蜡，100%、90%、80%、70%乙醇各5 min 覆水，柠檬酸钠缓冲液抗原修复，2%BSA 封闭非特异性抗原表位1 h，4 ℃过夜孵育一抗，次日常温避光孵育荧光标记的二抗2 h，DAPI 复染细胞核10 min，甘油明胶封片，应用激光共聚焦显微镜观察并拍照。

1.3 统计学分析

使用SPSS 21.0 软件对数据进行统计学分析，Graphpad Prism 8.0 软件进行图片制作，以平均值±标准差（±s）表示。 多组间比较采用单因素方差分析进行组间差异性分析，用Tukey’s 检验进行多重比较，生存率用Log-rank test 检验比较与无症状小鼠的指标差异，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 KPC 小鼠自发胰腺癌情况

将KP 小鼠与Pdx1-Cre小鼠合笼进行交配，新生的小鼠经琼脂糖凝胶电泳鉴定基因筛选得到24只KPC 小鼠（图1A）。 在饲养过程中密切关注KPC小鼠的状态，当出现体重下降、行动迟缓、精神萎靡或者腹部异常肿大时，通过体外无创超声监测技术观察其自发胰腺癌的情况（图1B）。 KPC 小鼠体重下降10%或者自发肿瘤体积达到800 ～1000 mm3，判断为仁慈终点，通过解剖再次确认KPC 小鼠自发胰腺癌的情况，其中4 只（16.66%）KPC 小鼠自发胰腺癌，平均寿命124.5 d；10 只（41.67%）KPC 小鼠自发皮下肉瘤，多发生在四肢，由于肉瘤发生较早，进展迅速，肿瘤负荷比较大，这类小鼠生存期最短，平均寿命92.5 d；其余10 只（41.67%）KPC 小鼠没有观察到明确的自发胰腺肿瘤和皮下肉瘤，平均寿命169.9 d（图1C ～1E）。 KPC 小鼠自发胰腺癌组织的HE 染色结果显示，肿瘤细胞呈无序排列，具有中等分化的导管样结构，间质成分丰富，富含胶原蛋白和各种免疫细胞。

2.2 组织块原位移植瘤模型构建

选择C57BL／6J 小鼠作为移植受体，将KPC 小鼠自发胰腺癌组织块移植到受体小鼠的胰尾，具体操作同方法“1.2.1”（图2A，2B）。 移植后，观察2～3 周，并通过体外无创超声技术监测移植肿瘤的生长速度（图2C），绘制生长曲线，结果显示，移植术后6 d 瘤体增长速度明显加快。 KPC1 在移植17 d 时，瘤体体积在（621.4 ± 180.9）mm3，KPC2 在移植13 d 时，瘤体体积在（744.9 ± 107.1）mm3，KPC3 在移植13 d 时，瘤体体积在（800.6 ± 142.9）mm3（图2D）。 表明这种方法构建的转基因小鼠源性胰腺癌组织块原位移植瘤具有稳定增殖能力。将冻存复苏后的肿瘤组织块移植于36 只C57BL／6J小鼠胰尾，其中35 只小鼠成功生长胰腺癌，肿瘤组织块冻存后复苏成功率高达97.22%。

2.3 模型评价

2.3.1 模型病理学特征稳定性的评价

肿瘤传代的病理学稳定性对于肿瘤研究具有重要意义，是评价肿瘤模型可靠性和可重复性的关键因素。 为验证转基因小鼠源性胰腺癌组织块原位移植瘤的移植稳定性，将其进行传代移植，在连续传代4 次后，取正常胰腺、P0 代原发胰腺癌组织和不同传代次数的原位移植瘤组织进行HE 染色，结果显示传代4 次后，KPC 小鼠P4 代原位移植瘤组织仍能保持其导管样腺体瘤形态，间质成分丰富，与P0 代原发胰腺癌组织形态一致，说明该模型能稳定地保留原发胰腺癌病理学特征（图3A）。

2.3.2 模型微环境相似性的评价

胰腺癌拥有复杂的微环境，包括致密的基质环境和独特的免疫浸润情况。 为了验证该模型的基质和免疫浸润情况，选择传代4 次的P4 代原位移植瘤组织和P0 代原发胰腺癌组织及正常胰腺组织进行对比。 首先，采用Ki67 和α-SMA 分别作为肿瘤增殖和基质纤维化的指标，通过免疫荧光染色技术分析其基质情况。 结果显示，第4 代原位移植瘤组织的增殖和纤维化程度相较于正常胰腺组织均明显升高，原位移植瘤组织的增殖和纤维化程度相较于KPC P0 代自发原位胰腺癌组织也有升高，Ki67阳性面积分别为（2.7500 ± 0.0841）%vs.（1.2730± 0.1652）%，α-SMA 阳性面积分别为（3.3110 ±0.3585）%vs.（2.2000 ± 0.1394）%，这说明原位移植瘤传代保持病理学特征的同时，还可以将其增殖能力和间质特征扩大（图3B）。 免疫荧光结果表明，正常胰腺组织、P0 代原发胰腺癌组织、第4 代原位移植瘤组织，均可发现不同程度的CD45 阳性免疫细胞和CD206 阳性免疫抑制细胞浸润，且与正常胰腺组织相比，P0 代原发胰腺癌和第4 代原位移植瘤组织的免疫细胞浸润数量更多（图3C）。 这说明该模型既能模拟胰腺癌的进展过程，也能真实地反映基质和免疫系统在胰腺癌进展过程中的作用。

2.3.3 模型肿瘤转移能力的评价

转移的发生一直是肿瘤学研究的热点，是肿瘤治疗失败和预后恶化的主要原因之一，构建具有肿瘤转移能力的药物临床前研究的动物模型对于揭示肿瘤转移机制和患者预后至关重要。 本研究构建的模型在仁慈终点还发生了广泛的侵袭转移，可以直接在腹膜、脾和肠道观察到肿瘤包块（图4A）。HE 染色及统计学分析结果显示，该原位胰腺癌模型96.67%发生肠转移，93.33%发生腹膜转移，76.67%发生脾转移，20%发生肺转移（图4B）。 另外，虽然肾和肝没有发生明显的肿瘤细胞转移病灶，但是观察到肾小球数量增多、体积增大，少数肝细胞发生坏死，凋亡小体增多（图4C）。 因此，该模型可以作为研究胰腺癌转移机制及预防治疗方案的药物临床前研究的动物模型。

3 讨论

胰腺癌基因工程小鼠模型能够反应胰腺癌患者遗传物质变化情况，完整地模拟了胰腺癌的发生与进展过程，富含丰富的肿瘤基质成分和免疫微环境，是研究胰腺癌最理想的动物模型[19]。 但是其造模周期长，胰腺癌自发时间不能预测，发生比例低，且不同个体自发的胰腺癌异质性强，同一时期获得足够实验的动物数量需要很多时间和经济成本，从而限制了应用[20]。

在自发胰腺癌KPC 小鼠的基础上，将肿瘤组织去除坏死部分，选择质地均匀的肿瘤部分修剪成大小一致的组织块，移植到野生的C57BL／6J 小鼠的胰尾，构建了基于KPC 自发胰腺癌肿瘤的原位移植瘤模型。 选择Ki67 作为肿瘤增殖指标，α-SMA 作为纤维化指标，评价胰腺癌的基质情况；CD45 作为免疫细胞标志物，CD206 作为免疫抑制细胞标记物，评价胰腺癌免疫细胞浸润情况[21-22]。 通过免疫荧光染色分析，该模型能够稳定的模拟并且遗传胰腺癌的导管腺瘤形态，具有良好的增殖能力，拥有与患者相似的纤维环境和免疫细胞浸润。 采用这种造模方式可以快速、大规模的进行胰腺癌相关研究。 为防止体内连续传代导致肿瘤生物学特征发生变化，选择将低代次（P0、P1 代）的肿瘤组织进行冷冻保存，复苏后原位移植成功率高达97.22%。除此之外，发现该模型中，胰腺癌能够转移到肠、腹膜等多器官，这与临床上胰腺癌发生转移的部位和病理特征相似，所以可以作为研究胰腺癌转移机制的优质模型。

实验过程中，需要有效的技术手段监测原位肿瘤的动态生长情况。 在本研究主要用到腹部超声动态监测了该模型的生长情况并绘制了肿瘤生长曲线。 超声波技术是一种无创、无辐射的方法，可以用来检测胰腺肿块，并评估其性质（囊实性、实质性）[23]。 为了获取清晰可靠的实验数据，在进行超声检查之前，需要对实验动物进行隔夜禁食，以减少胃肠蠕动对胰腺的干扰。 次日将造模小鼠呈仰卧位放置，沿腹主动脉横切扫查，以脾和肾的解剖位置辅助判断胰腺的大体位置，彩色多普勒成像显示血流，少血供、低回声区域即为胰腺肿瘤区域，通过计算获取胰腺肿瘤的体积大小。 尽管胰腺肿瘤超声检查的敏感性高度依赖于操作者的经验和疾病进展的程度，但其检查结果比较准确，能够作为胰腺肿瘤原位实验动物模型的影像诊断工具[24]。

构建转基因小鼠源性胰腺癌组织块原位移植瘤模型的优势在于其易于操作、成本相对较低，且肿瘤与人胰腺癌具有较高的生物相似性。 此外，这种模型可以更好地模拟肿瘤在体内生长和发展的过程，并为新药物的筛选提供可靠的动物模型[25]。然而，该模型也存在一些限制。 首先，该模型仍然是以小鼠作为宿主，而并非完全模拟人类的生理环境。 其次，这种模型对于特定基因突变类型的胰腺癌可能并不适用，因为不同的基因突变可能产生不同的生物学行为和病理学特征[26-27]。

综上所述，转基因小鼠源性胰腺癌组织块原位移植瘤模型是一种可行的模型，可以用于研究胰腺癌的发生机制和治疗方法的评估。 通过对模型的构建与评价，可以更好地了解胰腺癌的发展过程，并为治疗策略的研究提供有效的平台。