两种生育酚酯衍生物对D-半乳糖致衰老小鼠的抗衰老作用

陈炜莉，贝 翎，杨 扬，王璧莹，李家旭，阚绪甜，李文治，杜 冰,*

（1.华南农业大学食品学院，广东 广州 510642；2.无限极（中国）有限公司研发中心，广东 广州 510623）

衰老是以细胞、组织、器官功能进行性丧失为特征的自然生命过程，随着衰老程度的加剧，机体细胞寿命机制的有效性降低，使得衰老成为许多疾病的主要风险因素，包括心脑血管疾病、糖尿病、高血压等[1]。当前，科学界提出关于衰老机制的理论有自由基学说、线粒体DNA损伤学说、端粒学说、遗传程序学说等，其中自由基学说是目前研究和接受最广泛的学说[1-2]。自由基学说是指细胞有氧代谢时，自由基水平升高或抗氧化剂缺乏导致机体抗氧化能力降低，细胞毒性增强，并最终导致细胞膜、氨基酸链和DNA的分子结构不可逆转地受损，从而使机体老化[3]。因此，随着世界人口老龄化加快，抗氧化与抗衰老相关研究已成为当前的研究热点之一。

研究表明，过量的D-半乳糖会在体内积聚，在半乳糖氧化酶的作用下，可产生己醛糖和过氧化氢，促进氧自由基和超氧阴离子的产生，破坏大分子和细胞功能[4]；由于D-半乳糖诱导的小鼠衰老模型具有与正常衰老小鼠相似的症状，被广泛用于衰老机制的研究和抗衰老药物的筛选[5]。氧化应激和炎症是衰老的主要特征，许多研究表明，核因子-E2-相关因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）信号通路是迄今发现的最强大的抗氧化应激途径，在正常生理条件下，Nrf2以非活性形式存在于细胞中，而在氧化应激条件下，激活的Nrf2从细胞质进入细胞核，通过抗氧化元件反应（antioxidant response element，ARE）诱导特定基因的表达，从而调节II相抗氧化酶，如醌氧化还原酶（quinone oxidoreductase，NQO1）、血红素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1）等基因的表达，减轻氧化应激及炎症引发的机体损伤[4,6]。

长期以来，人们都用维生素来抵抗自由基的破坏，VE（生育酚）作为一种脂溶性维生素，具有抗氧化功能，可以保护细胞免受氧化损伤[7-8]。刘思彤等[9]的研究表明大豆异黄酮与VE对衰老模型小鼠肝组织病变都有减轻作用，且VE抗氧化能力比大豆异黄酮更强。Rattanawiwatpong等[10]研究发现，含VC、VE及树莓叶细胞培养提取物的血清能改善大部分皮肤老化现象（如皱纹、弹性低等）。VE可以被修饰成酯的形式，生育酚醋酸酯是一种比游离的VE更稳定的抗氧化性化合物，便于VE制品的贮存、运输等，是目前生产中常用的VE酯化衍生物之一[7,11-12]。在生育酚醋酸酯的衍生物中，D-α-生育酚醋酸酯属于天然形式，DL-α-生育酚醋酸酯属于合成形式。Yasin等[13]研究表明，在肉鸡中投喂适量α-生育酚醋酸酯能显著增加肌肉氧化稳定性和减少脂肪沉积，从而达到增强鸡肉氧化稳定性的目的。

因此，本研究将探究两种生育酚醋酸酯的体外抗氧化作用，并基于衰老模型，对比两者体内抗氧化及抗衰老作用，以期为寻找抗衰老物质提供相关的理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

雄性SPF级C57BL/6小鼠购自南方医科大学实验动物中心，生产许可证号：SCXK（粤）2021-0041。

D-α-生育酚醋酸酯、DL-α-生育酚醋酸酯由无极限（中国）有限公司提供；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、天冬氨酸氨基转移酶（astaxanthin，AST）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）检测试剂盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

万分之一天平 上海舍岩仪器有限公司；ANKE TDL-5-A型离心机 上海安亭分析仪器有限责任公司；Labserv K3酶标仪、PIKOREAL96荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；H1650R台式冷冻离心机湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；BioPrep-24生物样品均质仪 杭州奥盛仪器有限公司；DYY-6C电泳仪北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 体外抗氧化活性测定

1.3.1.1 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力测定

参照杨斯惠等[14]的方法并略作改动，将D-α-生育酚醋酸酯、DL-α-生育酚醋酸酯、VC用无水乙醇稀释成质量浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的溶液，取2.0 mL不同质量浓度的样液于离心管中，分别加入2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH自由基溶液，充分摇匀，暗反应30 min，以无水乙醇为参比溶液调零，在517 nm波长处用酶标仪测定吸光度，每个样品重复3 次。DPPH自由基清除能力按公式（1）计算：

式中：A2为样品的吸光度；A1为用无水乙醇替代DPPH溶液的对照组吸光度；A0用无水乙醇代替生育酚酯衍生物样品溶液的空白组吸光度。

1.3.1.2 羟自由基清除能力测定

参照王钰等[15]的方法，将D-α-生育酚醋酸酯、DL-α-生育酚醋酸酯、VC用无水乙醇稀释成质量浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的溶液，在510 nm波长处用酶标仪测其吸光度，每个样品重复3 次。

1.3.1.3 2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）阳离子自由基清除能力测定

参照蒋海艳等[16]的方法，将D-α-生育酚醋酸酯、DL-α-生育酚醋酸酯、VC用无水乙醇稀释成质量浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的溶液，在734 nm波长处用酶标仪测定其吸光度，每个样品重复3 次。

1.3.1.4 Fe2＋螯合能力测定

参照王肖行等[17]的方法，将D-α-生育酚醋酸酯、DL-α-生育酚醋酸酯、VC用无水乙醇稀释成质量浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的溶液，在562 nm波长处用酶标仪测定其吸光度，每个样品重复3 次。

1.3.1.5 总还原能力测定

参考王兵亚等[18]的方法并做改动。将样品用无水乙醇稀释成质量浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的溶液，取2.5 mL不同质量浓度的样品溶液于试管中，依次加入磷酸盐缓冲液（pH 6.6）和质量分数为5%的铁氰化钾溶液各2.5 mL，摇匀后于50 ℃下水浴20 min，再加入质量分数为10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，充分摇匀后以4 000 r/min离心15 min，取上清液2.5 mL，加入等体积的蒸馏水和质量分数为0.1%的FeCl3溶液，摇匀后静置10 min，在700 nm波长处用酶标仪测其吸光度，每个样品重复3 次。总还原能力按公式（2）计算：

式中：R为总还原能力；A1为样品溶液吸光度；A0为用无水乙醇替代样品稀释液作为空白对照测其吸光度。

1.3.2 衰老模型抗氧化及抗衰老作用分析

1.3.2.1 衰老模型建立及干预

参考Lei Shuwen等[19]的方法，72 只SPF级雄性小鼠经7 d适应性喂养后，随机分成6 组，每组12 只，分别为正常对照组（N C 组）、衰老模型组（S L M组）、DL-α-生育酚醋酸酯组（VEH组）、D-α-生育酚醋酸酯低剂量组（VECL组）、D-α-生育酚醋酸酯中剂量组（VECM组）、D-α-生育酚醋酸酯高剂量组（VECH组）。其中，除了NC组在颈背皮下注射0.9%生理盐水（0.1 mL/10 gmb）外，其余各组每日皮下注射300 mg/kgmb的D-半乳糖（0.1 mL/10 gmb）进行造模，同时VEH、VECL、VECM、VECH组每日经口给予生育酚酯衍生物的灌胃剂量分别为10、10、50、100 mg/kgmb，根据体质量计算给药体积（0.1 mL/10 gmb），持续42 d。

1.3.2.2 样品收集

实验结束后，小鼠禁食12 h，摘出眼球，用离心管收集血液，将采集的血于37 ℃孵育1 h后置于4 ℃冰箱过夜，4 000 r/min离心15 min后，取上清液即为血清。采血后，立即将小鼠颈椎脱臼处死，快速取出肝脏，并用预冷的生理盐水洗去血液，滤纸吸干表面水分后冻存待用。

1.3.2.3 抗氧化指标测定

按照相应试剂盒说明书分别测定血清中GSH-Px活力、T-AOC及MDA生成量。

1.3.2.4 血清炎症因子测定

按照相应试剂盒说明书分别测定IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

1.3.2.5 肝功能指标测定

根据相应试剂盒说明书分别测定肝功能指标血清AST、ALT水平。

1.3.2.6 Nrf2通路的mRNA表达水平分析

参考周意等[20]的方法，取0.02 g肝脏组织，利用TRIzol法提取肝脏组织总RNA，以肝脏组织总mRNA为模板，将RNA逆转录成cDNA，后采用SYRB荧光定量PCR试剂盒检测Nrf2、NQO1、HO-1的mRNA相对表达量，PCR引物由北京擎科有限公司设计合成，引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.3.2.7 Nrf2通路的蛋白表达水平分析

取0.025 g肝脏组织放入预冷缓冲液清洗，加入300 μL的RIPA裂解液，冰上裂解10 min后，在4 ℃、12 000 r/min离心15 min，收集上清液，即为提取的全蛋白。取120 μL蛋白上清液，加入30 μL 5×loading buffer混匀，沸水浴5 min，放入冰盒中速冷备用；根据蛋白定量结果，上样20 μL蛋白样品，进行SDS-PAGE电泳分离，转至NC膜上，封闭。加入稀释后的Nrf2（1∶1 000）、NQO-1（1∶5 000）、HO-1（1∶2 000）和β-actin（1∶5 000）抗体，室温放置60 min，4 ℃过夜，次日室温放置30 min。加入稀释后的二抗（1∶5 000），室温孵育90 min，显影，在凝胶成像系统成像。

1.4 数据统计分析

利用GraphPad Prism 9软件进行数据处理及绘图，采用单因素方差分析，P＜0.05，差异显著，结果用表示。

2 结果与分析

2.1 两种生育酚酯衍生物的体外抗氧化活性

2.1.1 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除能力常作为评价和寻找新的抗氧化物质的指标之一[21]。由图1A可知，当质量浓度大于0.3 mg/mL时，两种生育酚酯衍生物与VC的DPPH自由基清除能力接近。

图1 两种生育酚酯衍生物的体外抗氧化能力Fig.1 In vitro antioxidant capacity of two tocopherol ester derivatives

2.1.2 羟自由基清除能力

羟自由基为氧化能力极强的活性氧，羟自由基清除能力越大，表明抗氧化能力越强[22]。如图1B所示，质量浓度在0.1～0.3 mg/mL时，两种生育酚酯衍生物的羟自由基清除能力大于相同质量浓度的VC。当质量浓度为0.5 mg/mL时，羟自由基清除能力依次为VC＞DL-α-生育酚醋酸酯＞D-α-生育酚醋酸酯。

2.1.3 ABTS阳离子自由基清除能力

ABTS阳离子自由基清除能力可以用于评价极性和非极性样品的抗氧化性[23]。如图1C所示，当质量浓度为0.1～0.3 mg/mL时，两种生育酚酯衍生物的ABTS阳离子自由基清除能力高于相同质量浓度的VC，但当质量浓度为0.4～0.5 mg/mL时，三者清除能力接近。

2.1.4 Fe2＋螯合能力

抗氧化物螯合金属离子被公认为清除羟自由基的最佳途径，Fe2＋能诱导超氧阴离子生成对人体有害的羟自由基[24]。在0.1～0.5 mg/mL的质量浓度范围内，两种生育酚酯衍生物的Fe2＋螯合能力显著高于VC；D-α-生育酚醋酸酯在0.2 mg/mL时Fe2＋螯合能力最强，为95.98%；DL-α-生育酚醋酸酯在0.3 mg/mL时Fe2＋螯合能力最强，为88.78%。

2.1.5 总还原能力

抗氧化化合物利用本身还原作用给电子，从而清除自由基，总还原能力越强说明该物质抗氧化能力越强[17]。由图1E可知，质量浓度为0.1～0.5 mg/mL时，两种生育酚酯衍生物还原能力高于相同质量浓度下VC的还原能力，且随着质量浓度的提高，三者还原能力增加，呈现出一定的线性增长关系。

5 种体外抗氧化能力指标分析结果说明两种生育酚酯衍生物有相似的抗氧化能力，在0.1～0.3 mg/mL质量浓度范围内，二者的羟自由基清除能力、ABTS阳离子自由基清除能力、Fe2＋螯合能力和总还原能力均优于VC。

2.2 两种生育酚酯衍生物的对衰老模型小鼠体内抗氧化指标的影响

2.2.1 体内抗氧化指标

许多研究结果显示，D-半乳糖的注射诱导可加快小鼠衰老的速度，导致氧化应激并产生MDA，MDA水平可反映体内脂质过氧化的程度[25-26]；GSH-Px是机体重要的抗氧化酶，通过清除体内氧代谢生成的产物和维持谷胱甘肽活性从而维持细胞膜结构及其功能[27]；T-AOC是评价动物体内抗氧化酶和非酶系统水平的综合指标，可反映生物体的自由基代谢能力，T-AOC低表明机体抗氧化系统不活跃，导致脂质过氧化产物和自由基丰富[25]。由图2可知，SLM组小鼠的MDA含量显著高于NC组（P＜0.000 1），而GSH-Px活力和T-AOC显著低于NC组（P＜0.000 1，P＜0.001）。添加两种生育酚酯衍生物都能显著降低MDA含量，VEH组、VECL组、VECM组、VECH组依次降低63.85%、60.02%、64.16%、71.12%（P＜0.000 1）。添加两种生育酚酯衍生物显著提高了GSH-Px活力和T-AOC水平，VEH组、VECL组、VECM组、VECH组的GSH-Px活力分别升高78.33%、80.03%、88.86%、68.11%（P＜0.05，P＜0.000 1），T-AOC水平分别升高63.42%、45.45%、81.82%、118.18%（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001，P＜0.000 1）。Min等[28]研究发现补充VE可显著降低氧化应激大鼠血清中MDA含量，增加GSH-Px基因的表达从而提高氧化应激公鸡的抗氧化能力和免疫性能，这与本研究结果相似。综上，两种生育酚酯衍生物具有良好的抗氧化能力，对小鼠体内氧化应激损伤具有一定的改善作用。

图2 两种生育酚酯衍生物对小鼠体内抗氧化指标的影响Fig.2 Effects of two tocopherol ester derivatives on antioxidant indexes of mice

2.2.2 血清炎症因子

氧化应激的发生一般伴有炎症反应，氧化应激增强会刺激炎症因子的表达[29]。血清中促炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α能促进炎症反应进行，其含量越低说明机体免疫功能越强[30]。如图3所示，SLM组炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α含量比NC组显著提高（P＜0.000 1）。随着D-α-生育酚醋酸酯剂量的增加，小鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α含量显著降低，VECL组和VECH组小鼠的IL-6含量分别降低3.28%和9.88%，IL-1β含量分别降低1.71%和7.18%，TNF-α含量分别降低了13.88%和20.22%。VEH组的IL-1β和TNF-α含量比SLM组显著降低（P＜0.05），表现出比VECL组更好的抗炎效果。Barros等[31]研究发现含有维生素E醋酸酯的活性制剂对白色念球菌具有抗炎活性，与本研究结果相似。综上，两种生育酚酯衍生物能够降低由D-半乳糖诱导的衰老模型的炎症因子增加，从而达到抗衰老的目的，且相同剂量下DL-α-生育酚醋酸酯效果比D-α-生育酚醋酸酯好。

图3 两种生育酚酯衍生物对小鼠血清炎症因子的影响Fig.3 Effects of two tocopherol ester derivatives on serum levels of inflammatory cytokines in mice

2.2.3 肝功能指标AST、ALT

AST、ALT活性是目前临床上常用的反映肝功能受损程度的生化指标，在肝细胞受损时，可引起细胞膜的通透性改变，血清ALT水平增加，当线粒体进一步受到影响时，AST含量升高[32]。从图4可知，SLM组小鼠的AST和ALT活力较NC组显著增加，分别增加18.95%、40.32%（P＜0.000 1），而经过两种生育酚酯衍生物干预，小鼠的AST、ALT活力有所降低。VEH组小鼠血清中AST活力显著低于VECL组（P＜0.05），VEH组小鼠血清中AST和ALT含量比SLM组分别降低了7.20%、27.50%，VECL组则分别降低了5.81%、21.74%；经过D-α-生育酚醋酸酯干预小鼠的AST、ALT活力随着服用剂量增加而降低。Shah等[33]研究发现，在雄性鹌鹑日粮中添加松叶和维生素E醋酸酯能够降低鹌鹑血清中AST含量，与本研究结果相似。综上，两种生育酚酯衍生物能减轻肝功能受损程度。

图4 两种生育酚酯衍生物对小鼠AST、ALT的影响Fig.4 Effects of two tocopherol ester derivatives on liver AST and ALT activities in mice

2.2.4 Nrf2通路相关蛋白及其mRNA相对表达量

II相抗氧化酶NQO1和HO-1是Nrf2调控的下游靶蛋白，其中NQO1能催化醌类物质及其衍生物还原，从而降低其氧化毒性，HO-1能够与胆红素、一氧化碳等一起发挥抗氧化作用，当Nrf2作为关键转录因子移位到细胞核中与ARE区域结合时，导致II相抗氧化酶表达增强[34-36]。Nrf2通路中相关蛋白及其mRNA相对表达量的结果如图5所示，图6为相关蛋白的Western blot图。与NC组相比，SLM组的Nrf2、NQO1、HO-1的mRNA和蛋白相对表达量显著下降，mRNA相对表达量分别降低了88.74%、87.76%和89.53%（P＜0.000 1），蛋白相对表达量分别下降了92.42%、94.19%和95.77%（P＜0.001，P＜0.000 1）。与SLM组相比，各组干预下相关蛋白及其mRNA相对表达量不同程度上升。对于Nrf2、NQO1、HO-1mRNA而言，相比SLM组，VEH组Nrf2、NQO1、HO-1的mRNA相对表达量分别增加了514.08%、461.78%、515.32%（P＜0.000 1），VECH组则分别增加288.82%、282.39%、311.44%（P＜0.000 1）。对于Nrf2、NQO1、HO-1蛋白而言，相比SLM组，VEH组的Nrf2、NQO1、HO-1蛋白相对表达量分别增加了620.00%、988.89%、1 200.00%，而VECH组分别增加346.67%、533.33%、887.5%。给药剂量为10 mg/kgmb的DL-α-生育酚醋酸酯组Nrf2通路相关蛋白及其mRNA相对表达量都高于给药剂量为100 mg/kgmb的D-α-生育酚醋酸酯组。综上，两种生育酚酯衍生物可通过上调衰老小鼠Nrf2、NQO1、HO-1的mRNA和蛋白相对表达量，提高其体内抗氧化能力，抵抗氧化应激，从而具有抗衰老作用，且DL-α-生育酚醋酸酯效果优于D-α-生育酚醋酸酯。

图5 Nrf2通路中mRNA和蛋白相对表达量Fig.5 Relative mRNA and protein expression in the Nrf2 signaling pathway

图6 Nrf2、NQO1、HO-1的Western blot组图Fig.6 Western blot patterns of Nrf2,NQO1 and HO-1

3 结论

本研究通过测定两种生育酚酯衍生物的体外抗氧化能力，并采用D-半乳糖致小鼠衰老后，用两种生育酚酯衍生物进行干预。结果表明，两种生育酚酯衍生物具有较好的体外、体内抗氧化效果，能调节衰老小鼠血清中炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α含量的升高，能使衰老小鼠的AST、ALT活力有所降低，有利于肝功能的修复；与衰老模型组相比，两种生育酚酯衍生物干预后，小鼠NQO1、HO-1与Nrf2的mRNA和蛋白相对表达量增强，说明生育酚酯衍生物通过上调NQO1、HO-1、Nrf2的表达水平发挥其抗氧化作用，且DL-α-生育酚醋酸酯效果优于D-α-生育酚醋酸酯。综上所述，两种生育酚酯衍生物具有较强的抗氧化能力，并能通过提升Nrf2、NQO1、HO-1的mRNA和蛋白相对表达量缓解衰老。