富含蛋白质浓稠猴头菌乳的流变学及体外消化分析

苏翠馨，魏世杰，常明昌,2，冯翠萍,2，曹谨玲,3，云少君,3，徐丽婧,3，耿雪冉,3，程菲儿,3，孟俊龙,2,*，程艳芬,3,*

（1.山西农业大学食品科学与工程学院，山西 晋中 030801；2.山西农业大学 山西省食用菌工程技术研究中心，山西 晋中 030801；3.山西农业大学 山西省黄土高原食用菌重点实验室，山西 晋中 030801）

猴头菌（Hericium erinaceus，HE）又名猴头菇、猴头蘑等，隶属于担子门、伞菌纲、红菇目、猴菇科、猴头菌属[1]，是一种药食两用菌，味道鲜美、营养丰富[2]，含蛋白质、多糖等生物活性物质[3]。Wang Mingxing等[4]在研究HE对胃的保护作用时发现，HE多糖可以减少胃黏膜病变和胃溃疡的发生。马强等[5]在研究HE多糖分子质量与养胃活性效果时发现，HE子实体多糖分子质量的降低有利于提高其抗炎活性，对胃黏膜细胞的损伤修复作用可以得到进一步发挥。Vigna等[6]发现口服HE有助于缓解睡眠障碍。这些生理功效使HE成为食品深加工及保健食品研发的重要原料。

世界上约8%的人口受吞咽困难的影响，其中，老年患者约为13%～38%，其中以中度吞咽困难患者为主[7]。吞咽困难会影响食物摄取和营养吸收，导致患者出现营养不良等并发症[8]，严重时可能会导致死亡[9]。吞咽困难患者会出现一些生理变化，咀嚼能力下降和神经调节减慢，在吞咽食物时出现问题，如舌头递送食物的力量下降、会厌关闭气管的时间延迟[10]。吞咽困难还可能引起其他不良反应，包括脱水、营养不良和社交焦虑[11]。这一问题的主要解决方法是通过添加增稠剂，制得呈蜂蜜状的食物[12]，使吞咽更安全。增稠剂通常分为改性淀粉基和胶基两类[13]，前者在过去广泛使用，但后者因具有较好的适口性、质地和感官特征，最近越来越受欢迎[14]。但最常见的商品食用胶基增稠剂主要为黄原胶（xanthan gums，XG）、κ-卡拉胶（kappa carrageenan，KC）和羧甲基纤维素钠（carboxymethylcellulose，CMC），且来源不同[13]。增加蛋白质的摄入量可减少肌肉减弱综合症（肌少症）以及骨质疏松等疾病的发生，这在老年人中很常见[15]。2018年国际肌少症临床实践指南建议对肌少症的老年人患者进行蛋白质补充或增添富含蛋白质的饮食[16]。Li Chunlei等[17]研究表明补充乳清、大豆或乳清-大豆混合蛋白都可以保持老年人身体机能。Malafarina[18]和Helena[19]等研究表明蛋白质补充剂可以改善老年人的肌肉状况。

本实验以HE为原料，添加两种蛋白质（乳清蛋白（whey protein，WP）或大豆分离蛋白（soy protein isolate，SPI）），再分别添加3 种增稠剂（XG、KC或CMC）制备成富含蛋白质浓稠HE乳，研究其流动性和黏弹性以及体外消化特性。旨在为吞咽困难患者和老年人设计的食物提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

HE粉由山西农业大学食用菌团队提供；牛奶购自当地超市。

WP 美国希尔玛乳酪公司；SPI 临沂山松生物制品有限公司；KC 滕州市香凝生物工程有限责任公司；XG 新疆梅花氨基酸有限公司；CMC 宜兴通达化学有限公司；猪胃蛋白酶 美国Sigma公司；胰酶、胆汁酸盐 上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

MCR102流变仪 安东帕（上海）商贸有限公司；64R高速冷冻台式离心机 贝克曼库尔特（美国）股份有限公司；UV-1100型紫外-可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 富含蛋白质浓稠HE乳的制备

HE粉与牛奶按照不同比例配制基础HE乳（1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100（g/mL））。蒸煮3 min，混匀，由10 名男性和10 名女性根据HE乳的气味和口味等特征进行评分。将不同的蛋白质（WP或SPI）添加到基础HE乳中，通过凯氏定氮法[20]测得HE乳总蛋白质量达到总质量的10%以上。并分别向富含蛋白质HE乳中添加KC、XG或CMC，然后将样品搅拌均匀，并在4 ℃保存24 h。用流变仪测定表观黏度（η）达到约蜂蜜状（350～1 750 mPa·s）。将50 s-1的剪切速率作为评估表观黏度确保安全吞咽的标准[21-22]。

1.3.2 HE乳流动黏弹性的表征

用流变仪进行测定，椎板PP 50、间隙1 mm、温度37 ℃、剪切速率0.01～100 s-1，上样后等待180 s，在几何形状的外部添加硅油防止样品干燥。

1.3.2.1 稳态流变实验

按照1.3.2节描述的方法，进行样品的稳态流动行为测定。

1.3.2.2 黏弹性测试

通过应力扫描测试确定HE乳的线性黏弹性区域（linear viscoelastic region，LVR）。测试条件：剪切应变范围0.1%～100%，角频率0.1～100 rad/s。在LVR内，进行频率扫描测试，测定条件：间距1 mm；温度37 ℃；上样后等待180 s；频率1 Hz；应变1%；角频率扫描范围0.1～100 rad/s。温度扫描测试：间距1 mm；上样后等待180 s；频率1 Hz；应变1%；温度扫描范围15～80 ℃；扫描速率10 ℃/min。测定不同条件对HE乳的弹性模量（G′）、黏性模量（G″）、损耗系数（tanδ）、凝胶性能参数以及黏弹性参数的影响。

1.3.3 体外模拟唾液、胃和小肠消化

分别收集在2 h内未进食的健康的5 名男性和5 名女性的唾液，将新鲜唾液充分混匀，4 400×g离心10 min，取上清液，配制0.1 g/mL的HE乳溶液，将唾液上清液与HE乳充分混匀，37 ℃孵育4 h，沸水浴5 min，使唾液中的淀粉酶失活。

将10 mL唾液消化残液与4.0 mL的人工模拟胃液混匀，调pH值至3.0，37 ℃孵育6 h。孵育完成后，取适量消化液，沸水浴5 min，收集备用。人工模拟胃液由3.6 mL的胃电解质液（0.053 mol/L NaCl、0.15 mol/L KCl、0.001 mol/L CaCl2·2H2O和0.007 mol/L NaHCO3）和胃蛋白酶溶液（30 mg胃蛋白酶溶解于1 mL的1 mol/L CH3COONa中）组成。

将10 mL胃消化残液与4.0 mL模拟小肠液混匀。调pH值至7.0，37 ℃孵育6 h。孵育完成后，取适量消化液，收集备用。模拟小肠液由2.0 mL小肠电解质液（0.092 mol/L NaCl、0.009 mol/L KCl、0.002 mol/L CaCl2·2H2O）、1.0 mL胰酶溶液（1.25 g胰酶溶于5 mL蒸馏水）和1.0 mL胆汁盐溶液（4 g胆汁酸盐溶于100 mL蒸馏水）组成[23]。

1.3.3.1 消化HE乳的流动流变行为分析

利用上述消化过程，按照1.3.2节方法，对消化样品的流动流变性能进行测定，采用同轴圆筒（CP25/1°），测定η、流动系数（n）、稠度系数（K）、决定系数（R2）等参数。在10 s-1时（剪切速率接近生理学报道的值[24]）测量η值。

1.3.3.2 HE乳蛋白质消化率的测定

对消化前和模拟体外消化后获得HE乳的蛋白质消化率进行评估。测定总可溶性蛋白含量（Bradford法）、可溶性肽含量（三氯乙酸法）和游离氨基酸含量（双指示剂甲醛滴定法）。所有实验均重复3 次。

1.4 数据分析

结果由SPSS软件进行统计处理。数据采用单因素方差分析，均数比较采用Tukey-Kramer HSD检验。用不同字母表示结果有显著差异（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 富含蛋白质浓稠HE乳的制备

由图1a所示，当料液比为1∶60时，基础HE乳的风味评分最高，为90 分，HE具有淡淡的香味，无苦味。如图1b所示，随着蛋白质添加量的增加，SPI和WP质量分数增加，其中对照组最低，分别为1.947 6%和2.611 6%，当蛋白质添加量为10%时，SPI和WP质量分数高达25.986 8%和30.984 4%。按照膳食营养素参考摄入量标准[25]，推荐65 岁及以上老年人蛋白质摄入量为：男65 g/d，女55 g/d，故选用SPI和WP的添加量均为10%。

图1 HE乳的制备Fig.1 Preparation conditions of HE incorporated milk

根据李敏等[12]研究糊状饮食对中度吞咽障碍老年患者营养状态及吞咽功能的影响表明，使食物的黏度达到蜂蜜状（351～1 750 mPa·s）有助于中度吞咽困难的患者食用。样品在37 ℃、剪切速率为50 s-1、表观黏度为蜂蜜状（351～1 750 mPa·s）时，确定增稠剂的质量分数如表1所示。

表1 HE乳增稠剂的含量及表观黏度Table 1 Effect of thickener type and concentrations on apparent viscosity of HE incorporated milk

2.2 HE乳的流动特性和黏弹性

2.2.1 HE的流动特性

用流变仪测定HE乳的稳态流动特性，使用Herschel-Bulkley模型拟合流变参数。由表2所示，屈服应力（δ0）是样品开始流动所需的最小剪切应力，与其内部结构的破坏有关[26]。不同样品的δ0不同，归因于不同体系的紧密堆积，这是由于增稠剂提高了食物颗粒之间的凝聚力[27]。添加XG的HE乳在2 种蛋白质中都具有δ0，更有利于吞咽困难的人食用。不同HE乳的K值不同，其中HESPI-KC的K值最高，为819.55 Pa·s，HE-WP-KC的K值最低，为6.72 Pa·s。此外，所有HE乳的n值均小于1，表明它们在超过δ0后表现出剪切变稀的流动特性；n＜1的食物有利于吞咽[28]。这与Vieira等[24]为有吞咽问题的人设计不同增稠剂溶液的研究中观察到的结果一致。

表2 在37 ℃ HE乳稳定流动的流变参数Table 2 Steady rheological parameters of HE incorporated milk at 37 ℃

2.2.2 HE乳的黏弹性

图2显示了37 ℃ HE乳的G′、G″和tanδ值随频率的变化。在0.1～100 rad/s内，所有样品的G′＞G″，这表明样品为弱凝胶。tanδ＞1表示稀溶液，而在0.1～1之间表示弱凝胶[29]。所有样品的tanδ均在0.22～0.56之间，进一步证实了它们具有弱凝胶特性。这与Ribes等[30]的研究结果一致。

图2 不同HE乳的频率扫描Fig.2 Frequency scanning of HE incorporated milk

通过计算对数变化下HE乳的G′和G″斜率（分别为n′和n″）与频率的关系，进一步了解频率对G′和G″值的影响。用G0′-G0″值衡量凝胶强度，复模量（G*）与样品的刚度和硬度有关，而复合黏度（η*）是基于角频率评估产品的整体流动阻力[31]。在37 ℃、频率1 Hz条件下进行频率扫描，结果如表3所示。所有HE乳的n′和n″值都在0～1之间，表现为弱凝胶行为。HE乳的n″＞n′，表明G″比G′更依赖频率。这与Alvarez等[32]在海鲈鱼蔬菜泥和鸡肉蔬菜泥中描述的结论一致。HE-SPI-CMC的G0′-G0″值最高，这是由于带负电荷的羧基与蛋白质的阳离子结构域相互作用，使CMC形成强的网络结构，增加凝胶强度[33]。所有HE乳都表现出弹性行为（G′＞G″），这与Ribes[30]和Herranz[34]等的研究结果一致。HE-SPI-CMC的G*和η*值最高，因为这是增稠剂的阴离子结构域（带负电荷的羧基）和蛋白质的阳离子结构域（氨基酸）之间形成了强网络，从而加强了HE乳的结构[35]。所有HE乳的tanδ值均小于1，表明其具有弹性特性。Nyström等[35]指出高弹性的稀液体有利于吞咽困难的人食用。同样，Ishihara等[36]认为tanδ值在0.1～1之间可以作为易吞咽的流变学标准。因此，考虑到具有高抗变形性（高G*值）和良好弹性（低tanδ值）的食品吞咽更安全[37]，认为HESPI-XG、HE-SPI-CMC、HE-WP-XG、HE-WP-CMC和HE-WP-KC更适合吞咽障碍人群食用。

表3 HE乳的凝胶性能参数和黏弹性参数Table 3 Gel properties and viscoelastic parameters of HE incorporated milk

为了确定温度对样品结构变化的影响，从15～80 ℃进行温度扫描实验，如图3a、b所示，随着温度的升高，各样品G′和G″值基本都在减小。因为需要更多的热能克服螺旋内部链分子内和分子间键的能量。但当温度高于50 ℃时，HE-WP-XG的G′和G″增加，这是因为温度升高，HE乳中WP分子链与XG分子运动更加剧烈，又伴随着WP的变性，XG与WP相互作用增强，说明增稠的WP与XG具有强的物理纠缠网络结构，增稠的效果最好，从而加大了HE乳G′和G″值上升的趋势[38]。这与颜准等[39]研究溶液环境对吞咽障碍食品胶基增稠剂流变学性质的影响结果一致。如图3c所示，所有HE乳的tanδ值都在0.1～1，表明其具有良好弹性，有利于吞咽困难的人食用[40]。

图3 15～80 ℃不同HE乳的温度扫描结果Fig.3 Temperature scanning results of HE incorporated milk at 15-80 ℃

2.3 消化HE乳的流动流变特性

测定在体外胃肠消化过程中消化HE乳的流变特性参数η（10 s-1）、n、K和R2，结果见表4。所有HE乳基本表现出非牛顿剪切变稀行为（n＜1）。相比其他消化部位，口腔中η值最高。消化后的样品中，HE-WP-KC的η值和K值最高（分别为528.160 mPa·s和5.823 Pa·s），其次是HE-WP-XG和HE-SPI-XG，表明这些样品的结构受口腔α-淀粉酶的影响较小。HE-WP-KC在口腔和胃相的η和K参数差异最大，这可能是由于α-淀粉酶和胃蛋白酶的作用，WP的水解程度最高。肠消化阶段结束后，消化样品的η值和K值基本无显著差异（P＞0.05）。这与Ribes等[30]的研究结果相似。

表4 HE乳在体外胃肠消化过程中的流动流变行为参数Table 4 Rheological parameters of HE incorporated milk during in vitro gastrointestinal digestion

2.4 HE乳蛋白质消化率

通过测定消化期间HE乳的可溶性蛋白质、可溶性肽和游离氨基酸的含量评估HE乳的消化特性。如图4a所示，消化前，WP可溶性蛋白含量高于SPI，不同样品的含量在不同的消化阶段呈下降趋势。在消化后，添加不同增稠剂的HE乳可溶性蛋白含量基本无显著差异（P＞0.05），与样品的蛋白种类无关，这是因为α-淀粉酶的相互作用导致蛋白质沉淀或聚集，这一阶段不会发生蛋白质水解[41]。如图4b所示，与消化前相比，每个消化阶段HE乳多肽含量都在增加，尤其是在胃消化阶段，HE-SPI-CMC增长最高，为1.413 2 mg/g，HE-WP-KC含量（1.171 8 mg/g）次之，在胃蛋白酶的作用下，使得HE乳更容易消化。在胃消化阶段，HE-SPI-XG和HE-WPXG没有显著差异（P＞0.05）。消化完成后，HE-WP-KC的多肽含量高达1.491 8 mg/g，证明肠道酶（主要是胰蛋白酶）在水解蛋白质并生成肽和游离氨基酸方面发挥了关键作用。如图4c所示，在口腔消化阶段HE-WP-KC和HE-WP-CMC游离氨基酸含量无显著差异（P＞0.05）。消化完成后，WP的游离氨基酸含量高于SPI，表明添加WP的HE乳更易于人体消化和吸收。其中，HE-SPI-XG样品的游离氨基酸质量分数最低，为0.029 2%；HE-WPCMC最高，为0.034 1%，其次是HE-WP-KC、HE-SPIKC和HE-WP-XG。

图4 HE乳的蛋白质消化率Fig.4 Protein digestibility of HE incorporated milk

这些结果表明，虽然所有HE乳的初始蛋白质量分数都高达10%，但蛋白质消化率会受到样品组成、结构组织和理化性质的影响，这是由于添加的蛋白质及增稠剂与食物基质的相互作用[41]。蛋白质-增稠剂的相互作用取决于化合物的结构、组成、pH值、离子强度、电离度、电荷密度等[42]，并可通过增加或减少消化酶的作用影响食物消化。据报道，阴离子多糖如KC、XG可以减少胃肠消化期间牛奶、鸡蛋或大豆蛋白的分解，而海藻酸盐减少了胃消化期间的蛋白质水解[43]，但没有减少小肠消化期间的蛋白质水解[44]。

3 结论

富含蛋白质浓稠HE乳表现出剪切变稀的流动行为；HE-SPI-XG、HE-SPI-CMC、HE-WP-XG、HE-WP-CMC和HE-WP-KC具有高抗变形性和良好的弹性，更适合吞咽困难患者和老年人食用；在模拟体外消化实验中，HESPI-XG、HE-WP-XG和HE-WP-KC有较高的黏度和稠度，有利于老年人和吞咽困难的人食用；通过测定HE乳蛋白质的消化率，可知WP蛋白质含量高于SPI；HE-WPCMC和HE-WP-KC在消化完成后游离氨基酸的含量最高。本研究证实了添加蛋白质和增稠剂与食物基质之间的相互作用决定了样品的流变学特性和消化特性。综上所述，在设计适合吞咽困难或老年人的食品时，以WP为蛋白质源和KC为增稠剂制备食品是一个很好的选择。